空肠弯曲菌flaA、peb1A基因的克隆表达及单克隆抗体的制备

论文摘要

空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni,C.jejuni）是近十几年受到国内外学者广泛重视的一种重要的人畜共患的病原菌。该菌除引起人发热、急性肠炎、Reiter和Guillain-Barri综合征等疾病外,还可引起牛和绵羊流产,火鸡的肝炎和蓝冠病,童子鸡和雏鸡坏死性肝炎,雏鸡、犊牛、仔猪的腹泻等多种疾病,已成为全球范围内急性胃肠炎最常见的病因之一。本试验对空肠弯曲菌分离鉴定和保存的条件进行了优化,针对C.jejui可能的毒力因子鞭毛蛋白（FLA）和外膜蛋白（PEB1）基因进行了克隆测序、人工改造合成,高效地表达了FLA、PEB1,并利用表达的FLA蛋白筛选了针对空肠弯曲菌鞭毛的单抗;建立了flaA、peb1A基因常规PCR和套式PCR检测方法。分5组对空肠弯曲菌的培养气体条件,培养基、温度、时间、保存等条件进行了优化;参考GB、SN、FDA标准对样品进行人工布菌及分离鉴定,探讨其分离灵敏度;对南京市场的鸡肉、牛奶等食品的污染情况进行调查。结果显示将空肠弯曲菌以分区划线方式接种在Skirrow血平板,在5%O2、10%CO2和85%N2的混合气体三气培养箱中,37-42℃培养36-48h,生长最佳;加脱脂乳冻干后置于-80℃有利于该菌的长期保存;增菌前先分别将样品进行细菌富集处理,在增菌液中加入血、头孢哌酮,用双平板进行分离能有效地提高分离率,灵敏度可达到100CFU/mL或100CFU/g;南京市场部分样品随机抽取80份/种,其空肠弯曲菌的平均检出率分别为:生鲜鸡肉23.75%,冷冻鸡肉11.25%,牛奶16.50%,市场污水6.25%。由于空肠弯曲菌的传统检测方法耗时费力,易出现假阴性结果,本试验针对空肠弯曲菌flaA、peb1A基因的建立了常规PCR及套式PCR法对该菌进行检测。结果表明传统检测方法的灵敏度为45-100CFU/mL;常规PCR灵敏度10-20CFU/mL;套式PCR法灵敏度为2-6 CFU/mL。所建立的套式PCR方法在灵敏度等指标上均优于空肠弯曲菌的传统检测和常规PCR检测方法。根据已经发表的空肠弯曲菌NCTC11168（Pen2血清型）的flaA、peb1A基因序列,分别设计和合成2对引物,并以ATCC29428株的基因组为模板,通过PCR技术,扩增出flaA、peb1A基因片段,定向克隆至pMD18-T载体中并测序,利用DNAstar软件,将所测序列与不同来源弯曲菌的flaA,peb1A序列进行同源性比较;结果表明所克隆的基因与报道的NCTC11168flaA,peb1A基因序列核苷酸序列同源性分别为88.3%,98.1%。测序可知flaA、peb1A基因序列（G+C）%含量低,与E.coliBL21（DE3）的密码子兼并性较差,用软件改造合成了flaA（1-588bp）、peb1A（72-780bp）的区间序列,构建pET-28a（+）-flaAg、pET-28a（+）-peb1Ag表达载体;转化E.coli BL21（DE3）后诱导表达,SDS-PAGE鉴定表达产物,最高表达量占全菌总蛋白的70%左右;Ni2+-NTA亲和层析法收集表达的目的重组蛋白FLA、PEB1,用空肠弯曲菌全菌小鼠抗体的Westernblot鉴定FLA、PEB1免疫原性,间接ELASA试验鉴定FLA、PEB1免疫小鼠的抗血清,效价分别为1:12800,1:25600,结果表明FLA、PEB1具有良好的免疫原性,为亚单位疫苗的研制和单克隆抗体的筛选奠定了基础。用0.8%甲醛灭活的空肠弯曲菌ATCC29428株全菌作为抗原,常规免疫Balb/c小鼠,待ELISA抗体水平达到1:51200时,取脾细胞与对数期生长良好的Sp2/0进行融合;以粗提及表达纯化的鞭毛蛋白FLA包被的间接ELISA方法反复筛选和多次克隆化培养,筛选出能特异分泌抗FLA蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株;采用Westernblot对单抗进行生物学特性进行鉴定,获得3株持续、稳定分泌小鼠抗鞭毛单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为1G8、1G9和3F2,为建立夹心ELISA、免疫磁捕获等检测方法和进一步筛选保护性抗原奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一篇 文献综述
• 空肠弯曲菌概述
• 1 病原学
• 2 流行病学
• 3 分型方法
• 4 毒力因子
• 5 致病性
• 6 检测方法
• 7 预防和控制
• 第二篇 试验研究
• 第一章 食品和环境中空肠弯曲菌的分离培养和污染率调查
• 摘要
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• ABSTRACT
• 第二章 空肠弯曲菌flaA、peb1A基因常规PCR及套式PCR检测方法的建立
• 摘要
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• ABSTRACT
• 第三章 空肠弯曲菌flaA、peblA基因的克隆表达及免疫原性分析
• 摘要
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• ABSTRACT
• 第四章 空肠弯曲菌鞭毛蛋白单克隆抗体的制备
• 摘要
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• ABSTRACT
• 全文总结
• 致谢