高糖及其联合缺氧对HIF-1α表达的影响和shRNA抑制人RPE细胞HIF-1α表达的研究

论文摘要

目的观察早期糖尿病大鼠视网膜及人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelial，RPE）细胞在高糖及高糖联合缺氧的培养条件下缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达，探讨高糖及高糖联合缺氧对HIF-1α及VEGF表达的影响；并利用小发卡环RNA（small hairpin loop RNA，shRNA）使缺氧培养条件下的人RPE细胞HIF-1α基因沉默，观察对VEGF及色素上皮衍生因子（pigmentepithelium-derivedfactor，PEDF）表达的影响，探讨使缺氧条件下RPE细胞HIF-1α基因沉默能否有效地抑制RPE细胞VEGF的表达和促进PEDF的表达。方法1)使用链尿佐菌素（streptozotocin，STZ）腹腔注射制作大鼠早期糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）模型。于模型建立后1月处死大鼠，取眼球做石蜡切片及视网膜铺片。用免疫组化法检测HIF-1α及VEGF在视网膜的表达。用胰酶消化视网膜并行PAS视网膜血管染色，观察管视网膜血管形态变化。2)通过使用化学缺氧诱导剂CoCl2模拟RPE细胞缺氧环境，研究RPE细胞分别在5.56mM葡萄糖+0μM CoCl2（对照组）、5.56mM葡萄糖+150μM CoCl2（缺氧组）、25mM葡萄糖+0μM CoCl2（高糖组）以及25mM葡萄糖+150μM CoCl2（联合组）的培养条件下，通过RT-PCR检测HIF-1α及VEGF mRNA的表达，并使用Western印迹分析检测HIF-1α及VEGF蛋白水平。3)通过使用化学缺氧诱导剂CoCl2模拟RPE细胞缺氧环境，体外转录法合成针对HIF-1αmRNA序列的两个靶点的shRNA，对缺氧（150μMCoCl2模拟）的培养条件下人RPE细胞的HIF-1α进行干扰，通过RT-PCR检测HIF-1α、VEGF及PEDF mRNA的表达，并使用Western印迹分析检测HIF-1α、VEGF及PEDF蛋白水平。结果1)正常大鼠视网膜HIF-1α及VEGF染色为阴性表达，但在早期糖尿病大鼠视网膜HIF-1α及VEGF染色均为阳性表达，而视网膜血管形态变化不明显。2)与对照组相比，高糖组RPE细胞HIF-1αmRNA表达无显剧性差异，但高糖组可检测出微量的HIF-1α蛋白，对照组未能检测出HIF-1α蛋白；而VEGFmRNA表达和蛋白合成均增加。与缺氧组相比，高糖组联合缺氧组RPE细胞HIF-1αmRNA表达无显剧性差异，但HIF-1α蛋白水平有极显剧性差异；同时VEGF mRNA表达和蛋白合成也均明显增加。3)针对HIF-1αmRNA的两种shRNA均能有效地抑制RPE细胞在缺氧条件下HIF-1α的表达，同时也有效地抑制VEGF mRNA和蛋白表达，并促进PEDF蛋白表达，但对PEDF mRNA无影响。结论1)早期糖尿病大鼠视网膜的HIF-1可能由高浓度血糖诱导，从而上调VEGF的表达，在糖尿病视网膜新生血管的发生过程中可能起着重要的作用。2)高糖对体外培养的人RPE细胞HIF-1α的影响主要是促进蛋白的合成，且对HIF-1α蛋白有一定的稳定的作用，在联合缺氧条件下高糖促进合成的HIF-1α蛋白得到更好的稳定，同时也显剧促进VEGF的表达增加。3)针对HIF-1αmRNA的shRNA能有效地使缺氧条件下RPE细胞HIF-1α基因沉默，进而有效地抑制缺氧对VEGF的上调作用，同时也促进PEDF表达，从而使得VEGF／PEDF的比值更低，更有利于抑制视网膜新生血管形成。结果也揭示HIF-1与缺氧条件下PEDF翻译后的下调机制有关，是促进视网膜新生血管形成最为关键的细胞因子之一。

论文目录

• 前言
• 中文摘要
• Abstract
• 第一部分 早期糖尿病大鼠视网膜HIF-1α及VEGF的表达
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 第二部分 高糖及其联合缺氧对体外培养的人视网膜色素上皮细胞HIF-1α及VEGF表达的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 第三部分 shRNA抑制人RPE细胞HIF-1α基因表达对VEGF及PEDF表达影响
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 缺氧诱导因子1研究进展综述
• 1 HIF-1的结构
• 2 HIF-1在细胞对缺氧信息传递过程中的作用
• 3 HIF-1的调节途径和机制
• 4 HIF-1的靶基因
• 5 HIF-1与视网膜疾病
• 6 临床展望
• 文中用到的部分缩略词表
• 致谢