论文题目: 人胸腺素α1基因及乳铁蛋白基因在番茄中表达的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 生物化学与分子生物学
作者: 曹慧颖
导师: 郭三堆
关键词: 番茄,胸腺素,乳铁蛋白,转基因植物,遗传转化,生物反应器
文献来源: 中国农业科学院
发表年度: 2005
论文摘要: 胸腺素α1(Thymosin-α1,Tα1)是人体中枢免疫器官胸腺所分泌的一种免疫活性极强的多肽激素,其主要功能是促进T细胞功能,促进特异性抗体和细胞素的产生,起着加强免疫系统功能的作用,可以治疗自身免疫疾病如红斑狼疮、慢性乙肝、丙肝等,还可作为治疗癌症的辅助药物。但是,人体胸腺到20岁前后即开始萎缩,Tα1含量也随之下降,因此本研究将Tα1基因导入番茄,以期开发通过口服方式增加人体免疫力的新型保健产品。同时,我们还将大量存在于人初乳中,具有广谱抗菌、调节机体免疫机能、抑制人体肿瘤细胞生长等多种功能的人乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)编码基因也导入了番茄。 本研究首先根据植物偏爱密码子优化了人Tα1基因的核苷酸序列,然后人工合成了Tα1基因。由于Tα1基因非常小,为了增加其在植物中的表达量,我们尝试将它首尾相连形成四联体Tα1④,每个单体之间由肠激酶识别位点编码序列隔开,表达出的四联体小肽通过口服进入肠道后会被肠激酶分解成单体小肽而发挥作用。Tα1基因、Tα1④基因及经过密码子优化的lf基因被克隆到双元载体pBI121中,构建了植物表达载体pBI121Tα1、pBI121Tα1④、pBI121LF。同时我们还根据已报道的番茄果实成熟过程中受乙烯调控的果实特异性表达的E8基因启动子序列设计了引物,克隆了番茄中蔬5号的E8启动子,并构建了由E8启动子驱动lf基因表达的载体pBIE8LF,以及分别由CaMV35S启动子驱动Tα1基因和lf基因基因表达的双价植物表达载体pBITL。构建好的植物表达载体利用冻融法转入农杆菌菌株LBA4404中,并侵染了番茄子叶外植体,经过卡那霉素筛选,最终得到了再生植株67株。 再生植株经PCR、Southern blot检测,确定了转基因植株。除了使用E8启动子的植株由于果实尚未成熟不能检测以及Tα1的分子量太小不能进行电泳分析外,对其它转基因植株的果实进一步进行了Western blot检测,证明有多株植株分别表达了Tα1④和LF。番茄果实的ELISA定量分析显示,转化了pBI121LF和pBITL的果实中LF含量为7.9—15.7μg/g果实鲜重,转化了pBI121Tα1、pBI121Tα1④和pBITL的果实中Tα1含量为6.0—24.4μg/g果实鲜重。串联的Tα1④基因不但在番茄中表达了,而且平均表达量比含单体Tα1基因的番茄高出8.0μg/g果实鲜重。 转基因番茄中表达的Tα1、Tα1④和LF分别经过淋巴细胞增殖实验和抑菌实验,已经初步检测到了生物活性,为开发增加人体免疫力的保健食品苗打下了良好的墓础,具有一定的理论意义和实践意义。
论文目录:
第一章 绪论
1．1 植物生物反应器研究进展
1．1．1 植物生物反应器的优势
1．1．2 植物生物反应器存在的问题与展望
1．2 胸腺素α1研究进展
1．2．1 概述
1．2．2 胸腺素α1的结构
1．2．3 胸腺素α1的受体
1．2．4 胸腺素α1的生物学活性
1．2．5 胸腺素α1的临床应用
1．2．6 胸腺素α1的生产
1．3 乳铁蛋白的研究进展
1．3．1 概述
1．3．2 乳铁蛋白的功能
1．3．3 乳铁蛋白的结构及铁结合位点
1．3．4 乳铁蛋白的提取纯化方法
1．3．5 乳铁蛋白的检测方法
1．3．6 基因工程方法生产乳铁蛋白
1．4 转基因番茄研究进展
1．5 转基因植物的生物安全性
1．5．1 关于转基因植物的生物安全性的争论
1．5．2 转基因生物环境释放风险评估的基本原则
1．6 番茄果实特异性启动子
1．6．1 E8基因启动子
1．6．2 E4启动子
1．6．3 PG启动子
1．6．4 2A11启动子
1．7 植物遗传转化研究进展
1．7．1 植物遗传转化方法
1．7．2 植物遗传转化存在的问题与对策
1．8 本研究的目的、意义及研究方案
1．8．1 本研究的目的、意义
1．8．2 研究方案
第二章 Tα1及lf基因番茄表达载体的构建
2．1 材料与方法
2．1．1 材料
2．1．2 方法
2．2 结果与分析
2．2．1 Tα1基因的设计合成及克隆
2．2．2 果实特异性E8启动子的克隆
2．2．3 基础质粒的酶切图谱及鉴定
2．2．4 质粒载体的构建及其鉴定
2．3 小结
第三章 利用农杆菌介导法将人lf基因及Tα1基因导入番茄
3．1 材料与方法
3．1．1 材料
3．1．2 方法
3．2 结果与分析
3．2．1 番茄外植体的转化及再生植株的获得
3．2．2 再生植株的PCR检测
3．2．3 再生植株的Southern杂交鉴定
3．2．4 转基因植株的Western blot检测
3．2．5 外源蛋白的ELISA定量检测
3．2．6 外源蛋白活性检测
3．3 小结
第四章 讨论和结论
4．1 讨论
4．1．1．外源目的基因在番茄中的表达量
4．1．2 双价转基因番茄
4．1．3 启动子的选用
4．1．4 密码子的优化
4．1．5 Tα1基因的串联
4．1．6 转基因植物产品的生物安全性及应用前景
4．2 结论
4．3 本研究的创新点
参考文献
附录
致谢
作者简历
发布时间: 2005-09-05
参考文献
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