论文摘要
背景:有研究表明,无论是离体还是在体神经干细胞上都有NMDA受体的表达,NMDA受体对神经干细胞的增殖、迁移、分化、存活发挥重要作用。在哺乳动物脑内SVZ终身存在神经发生现象,是可能的内源性神经干细胞来源之一。越来越多的证据表明,NMDA受体可能与SVZ的神经发生活动有密切关系。然而NMDA受体是如何参与该区域神经发生的,其调节亚单位在其作用机制中又起到何种作用?在缺血性脑损伤中,NMDA受体亚单位的表达出现了怎样的变化?这些变化和其在缺血性脑损伤中对神经发生的调节机制有着怎样的关系?本研究将分两部分分别对上述问题进行探讨。第一部分目的:通过给予不同时期的新生大鼠NMDA受体及其亚单位激动剂和阻断剂,观察SVZ细胞增殖情况,同时观察NMDA受体及其亚单位激动剂和阻断剂对SVZ神经干细胞增殖的影响。方法:正常新生大鼠随机分成6组,即正常组、NMDA组、MK-801组、Ro25-6981组、NVP-AAM077组和生理盐水对照组。各组再随机分成P7 d（postnatal 7 days）、P14 d、P21 d、P28 d 4个时间点。在大鼠P3 d时腹腔注射NMDA受体激动剂NMDA（2 mg/kg/d）;选择性非竞争性NMDA受体阻断剂MK-801（10 mg/kg）;NR2A阻断剂NVP-AAM077（10 mg/kg）及NR2B阻断剂Ro25-6981（40 mg/kg）,每个时间点的大鼠在处死前24 h腹腔注射BrdU（50mg/kg）,间隔12 h重复注射一次,再间隔12 h分别灌注取脑,石蜡切片,各组行免疫组织化学染色观察Nestin、BrdU阳性细胞的变化情况,正常组另行HE染色。结果:（1）HE染色结果显示大鼠生后早期SVZ的细胞数和细胞密度随年龄呈下降趋势。BrdU免疫组化结果显示在P7 d时,NMDA组、MK-801组、Ro25-6981组细胞数较生理盐水对照组减少（P<0.05）;生理盐水对照组和NVP-AAM077组细胞数较MK-801组增多（P<0.05）。P14 d时NMDA组、MK-801组、Ro25-6981组细胞数较生理盐水对照组减少（P<0.05）;生理盐水对照组、NMDA组、NVP-AAM077组细胞数较MK-801组增多（P<0.05）。P21 d时NMDA组、Ro25-6981组细胞数较生理盐水对照组增多（P<0.05）;NMDA组细胞数较MK-801组增多（P<0.05）;NVP-AAM077组细胞数较MK-801组减少（P<0.05）。P28 d时NMDA组细胞数较生理盐水对照组增多（P<0.05）;NMDA组细胞数较MK-801组增多（P<0.05）。（2）Nestin免疫组化结果显示在P7 d时NMDA组、MK-801组、Ro25-6981组阳性细胞IOD值较生理盐水对照组降低（P<0.05）;生理盐水对照组、NMDA组和NVP-AAM077组阳性细胞IOD值较MK-801组升高（P<0.05）。P14 d时NMDA组、MK-801组、Ro25-6981组阳性细胞IOD值较生理盐水对照组降低（P<0.05）;生理盐水对照组、NMDA组、NVP-AAM077组阳性细胞IOD值较MK-801组有升高（P<0.05）。P21 d时NMDA组阳性细胞IOD值较生理盐水对照组升高（P<0.05）。P28 d时NMDA组、Ro25-6981组阳性细胞IOD值较对生理盐水照组升高（P<0.05）。结论:生后早期大鼠SVZ存在大量增殖细胞和神经干细胞。适度的激活NMDA受体可以促进SVZ中的细胞增殖,而抑制NMDA受体则会降低SVZ中的细胞增殖,这种抑制作用主要是通过抑制了NMDA受体的NR2B产生。第二部分目的:观察NMDA受体亚单位NR1在正常大鼠及前脑缺血再灌注大鼠SVZ神经干细胞的超微分布及表达变化,初步探讨NR1对缺血性脑损伤中神经发生进行调节的可能机制。方法:线栓法制作大脑中动脉栓塞（Middle cerebral artery occlusion,MCAO）2小时再灌注模型,分术后1、3、7、14天4个时间点取脑,之后对正常组、假手术组及MCAO组大鼠分别进行灌注固定,做150mm振动切片,取含SVZ脑片,经梯度蔗糖浸泡,液氮冻融处理后,室温下兔血清封闭;分别通过Nestin免疫组织化学法标记神经干细胞和免疫金-银标记显示NR1,光镜下拍照。之后取Nestin标记阳性细胞脑片行免疫金-银标记显示NR1,光镜下拍照。分别取Nestin、NR1及Nestin/NR1双标记的脑片的阳性部位,大小约1 mm3,经系列脱水,置换,国产618树脂浸润,包埋,聚合,修块,做70 nm超薄切片,经醋酸铀、枸橼酸铅双重染色,透射电镜观察、拍照。结果:（1）光镜下可见,各组大鼠SVZ均可见NR1阳性细胞,假手术组阳性细胞IOD值与正常组比较差异没有统计学意义（P>0.05）。MCAO-组大鼠NR1的IOD值在缺血后1 d开始增加,7 d达到高峰,14 d恢复至3 d水平;同样我们可以发现Nestin免疫组化染色结果中各组大鼠SVZ均可见Nestin阳性细胞,假手术组阳性细胞IOD值与正常组比较差异没有统计学意义（P>0.05）。MCAO-组大鼠Nestin的IOD值在缺血后3 d开始增加,7 d达到高峰,14 d恢复至3 d水平;Nestin/NR1免疫组化染色结果可见各组大鼠SVZ均有Nestin/NR1阳性细胞,假手术组阳性细胞IOD值与正常组比较差异没有统计学意义（P>0.05）。MCAO-组大鼠Nestin/NR1的IOD值在缺血后1 d开始增加,7 d达到高峰,14 d恢复至3 d水平。（2）通过透射电镜观察,大鼠脑SVZ Nestin免疫反应阳性产物呈黑色絮状电子致密物,分布于Nestin免疫反应阳性细胞的胞浆内;NR1免疫反应阳性产物呈黑色颗粒状,分布于SVZ各型细胞的胞膜、胞浆以及高尔基体和粗面内质网;神经干细胞内可见NR1免疫金颗粒与Nestin免疫组化产物共存。阴性对照样本未见任何标记。与正常组及假手术组比较可见脑缺血后SVZ神经干细胞上胞浆内NR1的显著增多,且NR1表达在1 d开始增加,7d达高峰（P<0.05）;此时,神经干细胞增殖达高峰。结论:缺血性脑损伤能够刺激成年大鼠脑SVZ神经干细胞的增殖;（2）脑缺血早期就可诱发SVZ神经干细胞的NR1表达增多,由于此增加模式和脑缺血诱导的神经干细胞增加的时程相一致,提示NR1可能参与SVZ神经干细胞增殖过程。