过表达Ralstonia eutropha H16基因prpE，prpP提高3-羟基戊酸在3-羟基丁酸3-羟基戊酸共聚物中的含量

论文摘要

聚羟基脂肪酸酯（PHA）是一类生物可降解的热塑性材料,其中3-羟基丁酸和3-羟基戊酸共聚物（PHBV）因为具有比聚3-羟基丁酸（PHB）更优良的低脆性和低结晶性,使得PHBV更适合商业应用。PHBV中3-羟基戊酸（3HV）的单体含量对共聚物的物理和机械性能有很大影响,因此,研究改变3HV的摩尔含量十分重要。本研究从Ralstonia eutropha H16中克隆一个丙酸通透酶基因（prpP）丙酸辅酶A合成酶（prpE）,基因prpP和prpE连同来自Ralstonia eutropha H16的PHA合成操纵子phCAB一起构建到质粒pBHR68-prpP和pBHR68-prpE上。转化pBHR68-prpP和pBHR68-prpE到大肠杆菌得到重组菌Escherichia coli XL10-Gold pBHR68-prpP和Escherichia coli XL10-Gold pBHR68-prpP。当重组菌Escherichia coli XL10-Gold pBHR68-prpP在含有葡萄糖和丙酸钠的混合碳源中培养60个小时后,可得到高3HV含量（14.3 mol%）,高分子量（～1100000 Da）和高PHA含量（62 wt%）的PHBV共聚物。研究结果表明过表达基因prpP在Escherichia coli XL10-Gold中,能够提高Escherichia coli XL10-Gold对丙酸的吸收和利用,改进了PHBV合成的代谢路径,导致了3HV单体在共聚物中含量提高。本研究同时把prpP基因克隆到广源宿主可穿梭载体pBBR1MCS-2中得到新的质粒PCS2-L01,介导质粒PCS2-L01到Ralstonia eutropha H16。利用葡萄糖酸钠和丙酸钠作为碳源,摇瓶培养重组菌Ralstonia eutropha H16 72个小时后可得细胞干重（CDW）,PHA含量（PHA/CDW）和3HV含量分别为:4.2 g/l,78.5 %和21.6 mol%。这个结果显示3HV在PHBV中的摩尔含量相比野生型Ralstonia eutropha H16高1.5-2.5倍。上面的研究结果表明,在Escherichia coli XL10-Gold和Ralstonia eutropha H16过表达丙酸通透酶基因prpP都能提高丙酸的吸收和利用,提高了3HV在PHBV中摩尔含量。这就为利用固定碳源组成,如工业废水和利用葡萄糖和丙酸作为混合碳源商业化发酵生产PHBV提供了潜力。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 聚羟基脂肪酸酯（PHA）概述
• 1.1.1 聚羟基脂肪酸酯（PHA）简介
• 1.1.2 3-羟基丁酸和3-羟基戊酸共聚物特性
• 1.2 PHA 研究现状
• 1.2.1 PHA 的发酵技术研究现状
• 1.2.2 PHA 代谢途径中的酶和基因及其克隆表达的研究现状
• 1.3 本项研究目的与意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 主要材料和仪器
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 质粒
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 试剂盒
• 2.1.5 培养基
• 2.1.6 主要仪器
• 2.1.7 分子量标准物
• 2.2 方法
• 2.2.1 菌种的培养及保存
• 2.2.2 分子生物学常规操作
• 2.2.3 R. eutropha H16 的接合转化
• 2.3 应用气相色谱（GC）对 PHA 进行检测
• 2.3.1 样品准备
• 2.3.2 标样的制备
• 2.3.3 GC 分析
• 2.4 分子设计辅助软件和网上数据资源
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 prpE, prpP 基因的克隆和分析
• 3.1.1 PCR 克隆 prpE 和 prpP 从 R. eutropha H16
• 3.1.2 质粒 pBHR68-prpE, pBHR68-prpP 和 PCS2-L01 的 构建
• 3.2 过表达prpE, prpP 基因生产高3HV 含量的PHBV
• 3.2.1 过表达prpE 和prpP 基因在 E. coli XL10-Gold
• 3.2.2 过表达prpE 和prpP 在R. eutropha H16
• 第四章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简历
• 学术论文与研究成果