论文摘要
目的:探索转录因子联合细胞因子诱导胎儿骨髓问充质干细胞（FBMSCs）分化发育为β功能样细胞。方法:（1）分别提取胎儿胰腺组织（自然流产的、经患者同意的、3-6个月大小）的总RNA,通过RT—PCR体外扩增人Pdx1、Pax4、NeuroD1、Nkx6.1等转录因子基因,分别克隆到pEGFP-N1或pIRES载体上,构成重组质粒;行L02细胞株转染,以观测目的基因表达、细胞内定位及功能基因的筛选。（2）应用酶切与酶连的方法构建功能上具有协同效应的PDX1与NKX6.1双基因表达的,并对MSCs高效感染率的腺病毒载体。（3）采用高压生理盐水灌冲并联合密度梯度离心法获取人胎儿骨髓组织中单个核细胞,应用贴壁筛选法分离、纯化和扩增胎儿骨髓间充质干细胞（FBMSCs）,观察细胞形态,绘制生长曲线,测定对数生长期的细胞倍增时间;检测细胞表面标志;并分别予以成骨和成脂诱导等功能性鉴定。（4）双基因腺病毒（Adxsi-CMV-Pdx1/CMV-Nkx6.1）感染诱导FBMSCs分化,并通过细胞基因表达谱的变化,初步鉴定目的细胞的分化发育阶段;分别应用多种细胞因子进行分步刺激,诱导细胞进一步分化与发育为β功能样细胞。（5）采用链脲佐菌素（STZ）成功制作糖尿病模型鼠后;将诱导的β样细胞植入糖尿病模型鼠肾被膜下,观测对糖尿病模型鼠的血糖调节能力。结果:（1）RT-PCR扩增获得Pdx1、Nkx6.1、NeuroD1与Pax4等转录因子基因并构建质粒载体pEGFP-N1/Nkx6.1、pEGFP-N1/Pax4、PIRES-Pdx1/NeuroD1等,酶切与测序鉴定表明载体构建成功。转染L02细胞后,RT-PCR、免疫细胞化学与间接荧光等检测均证实目的基因在细胞内表达,且相关蛋白分子主要存在于细胞核内。（3）成功构建对MSCs具有高感染效率的双基因表达腺病毒5型载体（Adxsi-CMV-Pdx1/CMV-Nkx6.1）,酶切与序列测定结果显示腺病毒载体构建成功。（4）原代培养的FBMSCs经过差速贴壁传代,第三代后细胞呈形态均一的长梭形,成行排列;流式检测显示,细胞表面标志CD106、CD44和CD29等阳性率均＞98%;HLA-DR、CD16、CD34、CD45和CD19等阳性率均＜2%;未经诱导的FBMSCs均不表达PDX1、NKX6.1、NGN3、GLUT2等转录因子。（5）FBMSCs经重组腺病毒Adxsi-CMV-Pdx1/CMV-Nkx6.1联合下游相应细胞因子分步诱导,细胞相互聚集成胰岛样小体,双硫腙染色细胞质阳性,RT-PCR显示细胞持续稳定表达目的基因Pdx1、Nkx6.1:联合下游第Ⅱ阶段细胞因子诱导后,胰岛素基因开始表达;当联合第Ⅲ阶段细胞因子作用后,MafA与GLUT2开始表达,约105个细胞分泌的胰岛素量达（340.4±59.3）mU/L;当在高糖环境下,胰岛素量达（639.8±85.1）mU/L。通过免疫细胞化学与间接荧光显示Pdx1、Nkx6.1与所诱导表达的NGN3与MafA等转录因子均在靶细胞的细胞核内表达,胰岛素、C-肽与GLUT2主要位于细胞质中;Western blotting检测也证实PDX1、NKX6.1均持续稳定表达,胰岛素在诱导的第Ⅱ阶段开始表达。（6）植入所诱导的细胞后第三天,糖尿病鼠血糖即可恢复正常水平,血糖稳定可持续27天以上。HE染色显示:细胞在肾包膜下多呈圆形,体积较大,胞浆丰富,嗜碱性,并有许多分泌泡样结构,将核挤向一侧,提示细胞分泌功能活跃:免疫组化显示细胞质胰岛素阳性;间接荧光亦显示细胞质中胰岛素与C-肽阳性;两对照组所移植的细胞均不能检测到胰岛素与C-肽。结论:（1）成功构建pEGFP-N1/Nkx6.1、pEGFP-N1/Pax4与pIRES-Pdx1/NeuroD1等质粒载体,经转染证实目的基因具有细胞核定位等生物学功能;筛选并成功构建具有协同效应的Pdx1与Nkx6.1双基因表达的腺病毒载体Adxsi.CMV-Pdx1/CMV-Nkx6.1。（2）本研究以参照国内外分离培养胎儿骨髓间充质干细胞（FBMSCs）方法为基础,采用高压生理盐水灌冲并联合密度梯度离心法分离,应用差速贴壁筛选法进一步分离、纯化并扩增FBMSCs,经多次传代后,细胞表面标志与功能鉴定提示本法可以获得相对较纯的FBMSCs.（3）本研究在PDX1与NKX6.1作用的基础上,联合细胞因子分步诱导FBMSCs向分泌胰岛素的B功能样细胞分化,结果所诱导的细胞具有主动摄取高浓度Zn2+,先后开始表达NGN3、MafA、GLUT2等β细胞特征分子;合成并分泌高水平胰岛素,且高浓度葡萄糖能刺激细胞分泌胰岛素;进一步在糖尿病模型鼠体内,该细胞具有降低血糖,并持续维持糖尿病鼠正常血糖的能力,改善STZ糖尿病大鼠的生存状态。结果提示本诱导方案可有效诱导FBMSCs分化为分泌胰岛素的β功能样细胞。
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相关论文文献
- [1].NKX6.1协同PDX1诱导人胎肝间充质干细胞分化为胰岛B样细胞[J]. 第二军医大学学报 2010(03)
- [2].PDX1联合NKX6.1促进骨髓间充质干细胞分化为胰岛β样细胞[J]. 中国病理生理杂志 2009(08)
- [3].PDX1与NKX6.1双基因表达腺病毒载体的构建、鉴定与表达[J]. 第三军医大学学报 2010(04)
- [4].大鼠NKx6.1启动子克隆及特异性表达分析[J]. 生物技术通报 2016(08)
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