白黄链霉菌TD-1抗菌活性物质发酵条件优化及分离纯化

论文摘要

为了研究新型抗菌活性物质与绿色饲料防霉剂,在实验室已筛选到一株拮抗白黄链霉菌TD-1的基础上,提高其活性物质的产量并对活性物质进行分离纯化。本论文主要从以下几个方面进行研究：白黄链霉菌TD-1抗菌物质发酵培养基及发酵条件的优化、活性物质的分离纯化及其理化性质的研究,主要研究结果如下。通过Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验、Box-Behnken试验并结合响应面分析,确定了最佳摇瓶发酵培养基配方及发酵条件：可溶性淀粉8g/L、黄豆饼粉8 g/L、 K2HPO40.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.01 g/L、KNO30.13 g/L、MgSO4·7H2O 0.34 g/L、NaCl 0.5 g/L、装液量80 mL/250mL、接种量12.75%、初始pH 7.2、温度30℃、发酵时间144 h、摇床转速180 r/min。优化后抗菌物质产量达到了8.42 mg/mL,是原始产量（4.29mg/mL）的1.96倍,表明优化后的发酵条件能显著提高活性物质的产量。利用溶媒萃取、硅胶薄层层析、硅胶柱层析、HPLC等方法对抗菌物质进行分离纯化。通过石油醚、乙酸乙酯萃取后,得到水相活性物质,对其进行第一次薄层层析,分离条件为氯仿-甲醇-水（4.5：5.5：0.5,v/v/v）（每毫升加4滴冰乙酸）。在第一次薄层层析的基础上,采用梯度洗脱法进行柱层析,大量制备活性物质。洗脱剂依次为：氯仿-甲醇（7：3,v/v）、氯仿-甲醇（1：1,v/v）、氯仿-甲醇（1：4,v/v）和100%甲醇。再进行第二次薄层层析,分离条件为氯仿-乙醇（1：1,v/v）（每毫升加4滴冰乙酸）。通过以上分离,最终得到了两个活性组分C1、C2。建立了活性组分C1的高效液相色谱检测方法。HPLC色谱条件为：色谱柱Angilent TC-C18 （250mm×4.6mm,5μm）;流动相乙腈：水（10：90,v/v）；流速0.3 mL/min;柱温30℃；检测波长210 nm；进样量20 μL。在此检测条件下对抗菌物质C1两个主要色谱峰进行了制备,其保留时间分别为10.793 min和14.152 min,以串珠镰刀菌为指示菌,采用牛津杯法进行生物活性检测,结果表明,两个组分都有活性。对活性组分C1进行pH纸层析试验、捷克八溶剂系统纸层析试验,所得图谱与碱性水溶性抗生素类图谱相似。在官能团测定实验中,茚三酮试验、Molish试验呈阳性反应,推断活性物质可能属于氨基糖苷类化合物,为后期物质结构鉴定奠定了基础。此外,稳定性试验表明,活性组分C1对热和紫外照射具有较强稳定性,但不耐酸碱处理,在分离纯化过程及后续应用中要尽量避免酸碱处理。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 链霉菌代谢产物的研究进展
• 1.1.1 链霉菌所产生物活性物质的种类
• 1.1.2 链霉菌所产生物活性物质的化学结构类型
• 1.1.3 链霉菌所产生物活性物质的抗菌作用
• 1.2 微生物发酵工艺优化
• 1.2.1 微生物发酵工艺优化策略
• 1.2.2 响应面优化设计在微生物发酵中的应用
• 1.3 分离纯化技术在微生物活性物质分离中的应用
• 1.3.1 经典分离方法
• 1.3.2 大孔吸附树脂
• 1.3.3 色谱分离法
• 1.4 论文的目的、意义及研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 培养条件
• 2.1.4 主要实验试剂
• 2.1.5 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 双层平板的制备
• 2.2.2 抗菌物质效价的测定
• 2.2.3 效价标准曲线
• 2.3 白黄链霉菌TD-1发酵培养基及发酵条件优化试验
• 2.3.1 Plaekett-Burman（PB）试验设计
• 2.3.2 最陡爬坡试验
• 2.3.3 Box-Behnken试验
• 2.4 验证试验
• 2.5 5L发酵罐放大试验
• 2.6 白黄链霉菌TD-1胞内活性代谢物质的分离提取
• 2.6.1 抗菌活性物质粗品制备
• 2.6.2 抗菌活性物质粗步分离
• 2.6.3 硅胶薄层层析色谱（TLC）分离
• 2.6.4 硅胶柱层析色谱分离
• 2.6.5 高效液相色谱纯化
• 2.7 白黄链霉菌TD-1抗菌物质C1理化性质初步研究
• 2.7.1 抗菌物质C1 pH纸层析
• 2.7.2 抗菌物质C1捷克八溶剂系统纸层析
• 2.7.3 抗菌物质C1官能团测定实验
• 2.7.4 抗菌物质C1稳定性的测定
• 3 结果与讨论
• 3.1 效价标准曲线
• 3.2 白黄链霉菌TD-1发酵优化
• 3.2.1 白黄链霉菌TD-1发酵主要影响因素的筛选
• 3.2.2 最陡爬坡实验
• 3.2.3 Box-Behnken和Response Surface Analysis试验
• 3.2.4 利用优化设计方法确定各因素的最优值
• 3.2.5 验证试验
• 3.3 5L发酵罐扩大实验
• 3.4 白黄链霉菌TD-1胞内活性代谢物质的分离纯化
• 3.4.1 活性物质的初步分离
• 3.4.2 硅胶薄层层析分离
• 3.4.3 硅胶柱层析
• 3.4.4 抗菌物质C1高效液相色谱（HPLC）分离
• 3.5 抗菌活性物质C1理化性质研究
• 3.5.1 抗菌活性物质C1 pH纸层析试验
• 3.5.2 抗菌活性物质C1捷克八溶剂纸层析
• 3.5.3 抗菌活性物质C1官能团预试
• 3.5.4 抗菌物质C1稳定性分析
• 4 结论
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 攻读硕士学位期间发表论文情况
• 8 致谢