微生物发酵产正丁醇工艺条件研究

论文摘要

化石能源的逐渐枯竭和环境污染的日益恶化已成为直接影响到人类社会可持续发展的两个重要问题。因此,寻找对环境污染小和可再生的能源对人们来说是十分必要的。丙酮丁醇发酵的主产物——生物丁醇,作为一种极具潜力的第二代生物燃料,以其独特的优势逐渐受到人们的重视。本文针对传统丙酮丁醇发酵的劣势,以优质发酵菌种为出发菌种,通过对代谢途径中相关酶的研究和发酵的工艺条件进行优化来提高溶剂的产量,期望为丙酮丁醇发酵的工业化生产提供一定的参考。本研究以实验室保藏的丙酮丁醇梭菌s1为出发菌株,通过热激方式对丙酮丁醇梭菌进行初步选择,并对得到的优质菌株S5的形态和生理生化特征进行了鉴定。所得到的菌株S5生成丙酮的浓度和淀粉利用率分别是1.76g/L和70.2%,生成丁醇的浓度约为3.52g/L,产溶剂的能力比S1高7.32%,淀粉利用率比S1提高了4.0%。研究了丙酮丁醇梭状芽孢杆菌（Clostridium acetobutylicum）中丁醇代谢途径的关键酶——依赖NADH的丁醇脱氢酶（Butanol Dehydrogenase,BDH）,对该酶进行了分离纯化及酶学性质研究。结果表明,粗酶液分别经过饱和度为20%和60%的硫酸铵沉淀及SephadexG-75凝胶柱层析,丁醇脱氢酶的比活力达到256.7U/mg,纯化倍数提高至12.7倍,回收率为28.9%。丁醇脱氢酶的最适反应温度是35℃,最适反应pH是6.0。在单因素试验基础上,利用Plackett-Burman试验设计法对影响丙酮丁醇梭菌发酵的9个影响因子——装液量、温度、（NH4）2SO4、ZnSO4-7H2O、FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、吐温80、CaCO3和Na2S2O3进行筛选,结果筛选到三个具有显著性的影响因子,即温度、CaCO3和（NH4）2SO4。然后采用响应面法优化法对发酵过程进行优化,由极值条件下的发酵结果可知,丙酮的预测最优值为3.24481g/L,丙酮实际产量为3.06g/L,丁醇实际产量为6.12g/L,预测值与实际值比较接近。丙酮和丁醇的产量分别由最初的1.76g/L和3.52g/L增加到优化后的3.06g/L和6.12g/L,丙酮丁醇产量提高了73.8%。因此响应面法所建立的模型可以很好地解释丁醇发酵与影响因素之间的关系,说明该方法用于丁醇发酵是可行的,并确定了最佳的发酵工艺条件：其接种量为5%,种龄约18h,装液量为100ml,玉米粉7%,CaCO30.55%,（NH4）2SO40.27%,初始pH为7.0,35.5℃静置培养。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1 发酵法产正丁醇概述
• 1.1 研究背景
• 1.2 生产历史
• 1.3 丙酮丁醇生产方法
• 1.4 丙酮与丁醇的性质及用途
• 1.4.1 丁醇的性质及用途
• 1.4.2 丙酮的性质及用途
• 1.5 生物丁醇作为生物燃料所具有的优势
• 2 国内外研究现状
• 2.1 发酵菌种
• 2.2 ABE发酵生物代谢途径
• 3 生物发酵生产丁醇存在的主要问题与展望
• 4 论文的立题意义及主要研究内容
• 第二章 发酵菌株丙酮丁醇梭菌的复壮与性质研究
• 1 材料与方法
• 1.1 菌种
• 1.2 培养基
• 1.3 菌种选择
• 1.3.1 复壮
• 1.3.2 热激选择优质菌株
• 1.4 菌种性质鉴定
• 1.5 发酵底物的选择
• 1.6 测定方法
• 1.6.1 气相色谱检测发酵产物
• 1.6.2 化学方法测定产物浓度
• 1.6.3 淀粉利用率
• 2 结果与分析
• 2.1 发酵产物的测定
• 2.2 菌种复壮
• 2.3 热激复选
• 2.4 菌种性质鉴定
• 2.4.1 菌体形态
• 2.4.2 生理生化特征
• 2.5 丙酮丁醇梭菌发酵底物的选择
• 3 讨论
• 第三章 丙酮丁醇梭菌代谢关键酶研究
• 1 材料与方法
• 1.1 菌种
• 1.2 培养基
• 1.3 方法
• 1.3.1 菌种活化与发酵培养
• 1.3.2 丁醇脱氢酶粗酶液的制备
• 1.3.3 丁醇脱氢酶酶活测定
• 1.3.4 蛋白质浓度的测定
• 1.3.5 丁醇脱氢酶的分离纯化
• 1.3.6 醇脱氢酶的SDS-PAGE分析
• 2 结果与分析
• 2.1 分离纯化结果及分析
• 2.2 Sephadex G-75柱色谱洗脱曲线
• 2.3 SDS-PAGE电泳鉴定分析
• 2.4 丁醇脱氢酶酶学性质研究
• 2.4.1 粗酶液中丁醇脱氢酶的稳定性
• 2.4.2 丁醇脱氢酶的最适反应温度
• 2.4.3 丁醇脱氢酶的最适反应pH值
• 3 讨论
• 第四章 微生物发酵产正丁醇工艺条件优化
• 1 材料与方法
• 1.1 菌种
• 1.2 培养基
• 1.3 测定方法
• 1.3.1 丙酮含量的测定
• 1.3.2 淀粉利用率
• 2 结果与分析
• 2.1 单因素试验
• 2.1.1 细菌生长曲线和种龄的确定
• 2.1.2 接种量对发酵结果的影响
• 2.1.3 玉米粉浓度对发酵结果的影响
• 2.1.4 培养温度对发酵结果的影响
• 2.1.5 初始pH值对发酵结果的影响
• 2.1.6 培养方式对发酵结果的影响
• 2.2 Plackett-Burman试验设计筛选重要影响因子
• 2.3 Box-Behnken设计响应面法优化
• 2.4 极值与极值条件分析
• 2.5 极值条件下的验证
• 3 讨论
• 第五章 结论及下一步研究计划
• 参考文献
• 附录A:图片
• 附录B:主要试剂及培养基配制
• 附录C:主要仪器
• 致谢
• 作者简介