韭菜迟眼蕈蚊卵黄蛋白的生化特性、纯化及卵黄发生的激素调控

论文摘要

本文对韭菜迟眼蕈蚊Bradysia odoriphaga卵黄蛋白的生化特性、纯化和卵黄发生的激素调控进行了初步研究,旨在阐述其卵黄发生的激素调控机制和探明该卵黄蛋白与其他双翅目昆虫卵黄蛋白之间的关系。利用native-PAGE和SDS-PAGE对韭菜迟眼蕈蚊卵、卵巢、血淋巴和脂肪体中的卵黄（原）蛋白进行了鉴定,PAGE测得卵黄原蛋白（Vg）和卵黄蛋白（Vn）的分子量分别是138.85kDa和148.38kDa,SDS-PAGE测得卵黄蛋白和卵黄原蛋白均由3个分子量相同的亚基组成,分别是75.47kDa、41.49kDa和39.54kDa。先利用硫酸铵沉淀法浓缩卵黄蛋白样品,再经凝胶过滤层析和阴离子交换层析进一步纯化卵黄蛋白,最后经PAGE鉴定得到两条蛋白带,其中分子量较小的蛋白为目的蛋白Vn,另一条则是一种分子量约440kDa的蛋白。两条蛋白带始终没有分离的趋势,推测这两种蛋白存在某种特殊联系,而且440kDa蛋白的分子量约是Vn的3倍,有可能是Vn的三聚体。用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定了蚊蝇醚、早熟素Ⅱ（抗保幼激素）和植物源蜕皮激素处理的白蛹在不同发育时期脂肪体和卵巢内卵黄（原）蛋白的动态,分析了外源激素对脂肪体和卵巢中卵黄原蛋白合成与吸收的影响。蚊蝇醚（0.8μg /μl）能促进脂肪体合成卵黄原蛋白和卵巢摄取卵黄蛋白;早熟素Ⅱ通过作用于咽侧体抑制保幼激素合成使脂肪体卵黄原蛋白的合成受阻,使卵巢内卵黄蛋白沉积减少;而蜕皮激素则对卵黄蛋白的合成也有一定的促进作用。在用ELISA测定韭菜迟眼蕈蚊蛹不同发育时期卵巢卵黄蛋白动态的基础上,利用高效液相色谱（HPLC）测定了不同发育时期雌蛹体内保幼激素和蜕皮激素的滴度。JH滴度从白蛹到V期上升,至V期最大,然后下降,雌虫体内JHШ的滴度变化与卵黄发生过程中脂肪体内卵黄蛋白含量变化趋势相似,表明JH调控脂肪体合成卵黄蛋白。蜕皮激素从白蛹至灰蛹无明显变化,至黑蛹期却明显上升,似乎与卵黄蛋白的合成或卵巢摄取卵黄蛋白无相关性。

论文目录

• 摘要
• 英文摘要
• 第一部分 文献综述
• 1 昆虫卵黄蛋白种类
• 1.1 Vg 类卵黄蛋白
• 1.1.1 卵黄原蛋白（Vitellogenin, Vg）
• 1.1.2 卵黄多肽（yolk polypeptides, YP）
• 1.2 非 Vg 类卵黄蛋白
• 2 卵黄蛋白的理化性质及结构特点
• 2.1 卵黄蛋白的理化性质
• 2.2 卵黄蛋白的结构特点
• 2.2.1 聚丝氨酸功能区
• 2.2.2 Vg 前体的裂解位点
• 2.2.3 卵黄蛋白的进化关系
• 3 卵黄蛋白基因
• 3.1 卵黄蛋白基因的结构
• 3.2 卵黄蛋白基因的调控因子
• 4 昆虫的卵黄发生及激素调控
• 5 选题依据和意义
• 第二部分 试验研究
• 第一章 韭菜迟眼蕈蚊卵黄蛋白的理化性质与分离纯化
• 1 材料与方法
• 1.1 供试昆虫和试验解剖虫态
• 1.2 主要化学试剂
• 1.3 主要仪器设备
• 1.4 样品的准备
• 1.4.1 电泳用蛋白样品的收集
• 1.4.1.1 卵样品的获取
• 1.4.1.2 卵巢样品的获取
• 1.4.1.3 脂肪体样品的收集
• 1.4.1.4 血淋巴的收集
• 1.4.2 纯化用卵黄蛋白样品的获取
• 1.5 卵黄蛋白的鉴定与分子特性
• 1.5.1 native-PAGE 不连续电泳
• 1.5.1.1 样品
• 1.5.1.2 主要储液配方
• 1.5.1.3 电泳步骤
• 1.5.2 SDS-PAGE 不连续电泳
• 1.5.2.1 样品处理
• 1.5.2.2 主要储液配方
• 1.5.2.3 电泳步骤
• 1.6 卵黄蛋白的纯化
• 1.6.1 卵黄蛋白浓度的测定
• 1.6.2 硫酸铵沉淀
• 1.6.3 Sephacryl S-200 凝胶过滤层析纯化
• 1.6.3.1 Sephacryl S-200 装柱
• 1.6.3.2 卵黄蛋白的纯化步骤
• 1.6.4 DEAE-Sepharose Fast Flow 阴离子交换层析
• 2 结果与分析
• 2.1 卵黄蛋白的鉴定及分子特性
• 2.1.1 native-PAGE
• 2.1.2 SDS-PAGE 不连续电泳
• 2.2 卵黄蛋白的纯化
• 2.2.1 卵黄蛋白的浓度测定
• 2.2.2 Sephacryl S-200 凝胶过滤层析
• 2.3 阴离子交换层析
• 2.4 各纯化步骤结果对比
• 3 讨论
• 第二章 外源激素对韭菜迟眼蕈蚊卵黄蛋白含量的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 供试虫源
• 1.2 试剂
• 1.3 处理方法及样品收集
• 1.3.1 蚊蝇醚处理
• 1.3.2 早熟素Ⅱ处理
• 1.3.3 植物源蜕皮激素处理
• 1.4 卵黄蛋白抗体的制备
• 1.4.1 卵黄蛋白抗血清的制备
• 1.4.2 抗血清的采集
• 1.4.3 效价的测定
• 1.5 卵黄蛋白抗体的纯化
• 1.5.1 主要仪器与试剂
• 1.5.2 DEAE-52 纤维素的处理
• 1.5.3 IgG 的纯化
• 1.5.4 IgG 蛋白浓度的测定（Bradford 检测法）
• 1.5.4.1 试剂与仪器
• 1.5.4.2 常量法标准曲线制作
• 1.5.4.3 IgG 蛋白浓度的测定
• 1.6 卵黄蛋白的 ELISA 试验（间接法）
• 1.6.1 试剂
• 1.6.2 仪器
• 1.6.3 操作方法
• 2 结果与分析
• 2.1 琼脂糖免疫双扩散试验
• 2.2 兔抗血清标准曲线
• 2.3 外源激素对卵黄发生的影响
• 2.3.1 蚊蝇醚处理韭菜迟眼蕈蚊组织中卵黄蛋白含量的动态
• 2.3.2 早熟素处理韭菜迟眼蕈蚊组织中卵黄蛋白含量的动态
• 2.3.3 植物源蜕皮激素处理韭菜迟眼蕈蚊组织中卵黄蛋白含量的动态
• 3 讨论
• 第三章 韭菜迟眼蕈蚊卵黄发生与保幼激素和蜕皮激素的关系
• 1 材料与方法
• 1.1 韭菜迟眼蕈蚊不同发育时期卵黄蛋白的动态测定
• 1.2 保幼激素和蜕皮激素的测定
• 1.2.1 试剂
• 1.2.2 仪器
• 1.2.3 色谱条件
• 1.2.3.1 保幼激素色谱条件
• 1.2.3.2 蜕皮激素色谱条件
• 1.2.4 供试虫源及样品
• 1.2.5 样品制备
• 1.2.5.1 测定保幼激素含量的样品制备
• 1.2.5.2 测定20-羟基蜕皮酮含量的样品制备
• 2 结果与分析
• 2.1 韭菜迟眼蕈蚊不同发育时期卵黄蛋白的动态
• 2.2 保幼激素滴度的测定
• 2.2.1 标样色谱图
• 2.2.2 样品色谱图
• 2.2.3 保幼激素测定结果
• 2.3 蜕皮激素滴度的测定
• 2.3.1 标样色谱图
• 2.3.2 样品色谱图
• 2.3.3 蜕皮激素测定结果
• 3 讨论
• 第三部分 结论
• 第四部分 总讨论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况