利用PMCA对PrPSc在外周组织复制和NADPH促进PrPSc扩增的研究

论文摘要

可传播性海绵状脑病（transmissible spongiform encephalopathies,TSEs）,又称朊病毒病（prion disease）,是一类由于中枢神经系统中的细胞型PrPC（cellularPrP）发生错误折叠转变成为致病构象PrPSc而引起的致死性神经退行性疾病。这类疾病包括人类克雅氏病（Creutzfeldt-Jakob disease,CJD）、致死性家族型失眠症（fatal familial insomnia,FFI）、格-斯-斯综合征（Gerstmann-Straussler-Scheinkersyndrome,GSS）,以及牛海绵状脑病（bovine spongiform encephalopathy,BSE）和羊瘙痒病（scrapie）等。根据病因不同可分为散发型、遗传型和医源型三种形式。研究PrPSc如何利用PrPC进行复制扩增,对于阐明朊病毒病的发病机制以及开发针对朊病毒病的预防和治疗手段具有重要意义。在本研究中,我们利用蛋白错误折叠循环扩增（protein misfolding cyclicamplification,PMCA）技术研究了PrPSc在体外的复制特点。我们首先揭示了天然PrPSc分子具有利用外周组织PrPC进行复制的能力,羊瘙痒毒株263K感染实验仓鼠脑组织的PrPSc具有在同源脾脏和肌肉中高效复制的能力,其复制能力与在脑组织中相似。随后我们发现通过PMCA新生成的PrPSc与天然PrPSc在主要的生物化学特点上高度相似,包括蛋白酶K抗性、糖基化比例和体外持续复制能力等。我们还观察到PMCA生成的PrPSc对NaOH和高温也具有明显的抵抗力。这些结果证实,PrPSc能利用外周组织中的PrPC进行复制,提示在自然感染过程中朊病毒可以在神经外组织中增殖。比较在体外经PMCA产生的PrPSc与经动物感染试验产生的PrPSc在主要生物学和物理化学特性,高度提示了利用PMCA技术可以部分替代动物试验研究和检测朊病毒的可行性。我们还利用PMCA技术研究了还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）对PrPSc复制扩增的影响。我们发现在NADPH存在时,PrPSc在PMCA的增殖能力明显增强,并且这种扩增促进效应与NADPH的浓度具有剂量依赖效应,并与NADPH的氧化/还原状态密切相关。我们还观察到另一种还原型吡啶核苷烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）也具有类似的促进效应。但其它的结构或功能类似物,如氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）和氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）,以及同样在生化反应中具有电子供体作用的抗坏血酸（ascorbate）,却不能明显促进PrPSc的增殖。我们还利用原核表达的重组野生型仓鼠全长PrP（23-231）在经Cu2+处理复性后与PrPSc混合进行PMCA,结果发现当NADPH存在时,羊瘙痒病263K的PrPSc能够将原核表达的仓鼠PrP转化成具有蛋白酶K抗性的蛋白,但这种PrPSc不能诱导原核表达的重组人全长PrP（23-230）产生PK抗性。这些结果提示,还原型吡啶核苷能够通过直接作用于PrPC分子本身的方式促进PrPSc的体外扩增,这种促进作用可能源于这类化合物所具有的电子供体职能和吡啶核苷的分子结构特点。同时也提示,这种促进作用在PMCA中不能突破种属屏障,这与动物感染试验中所表现出来的PrPSc种属特异性结果一致。这些结果高度提示还原型吡啶核苷类化合物可能在朊病毒病发病过程中起到促进PrPSc复制的作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 试验材料与试验方法
• 试验结果
• 讨论
• 试验小结
• 参考文献
• 综述
• 缩略词对照表
• 个人简历
• 致谢
• 附录1
• 附录2