茎瘤固氮根瘤菌ORS 571与小麦互作机理的初步研究

论文摘要

茎瘤固氮根瘤菌是一种内生固氮菌,它可以促进禾本科作物的生长。为了探讨茎瘤固氮根瘤菌与小麦互作的机理,本实验构建原核表达载体,为弄清根瘤菌的内生定殖规律奠定了基础;选取小麦不同生长时期的样品,对代表固氮水平和矿质元素吸收的硝酸还原酶,代表抗逆性的丙二醛含量和过氧化物酶活性进行了测定;利用实时定量PCR技术,对固氮菌与小麦互作初期防卫反应相关基因的表达情况进行了检测。结果表明:（1）将质粒pEGFP-C1中EGFP基因克隆至原核表达载体pGEX-4T-1上,成功构建重组质粒pGEX-4T-EGFP。下一步计划将重组质粒转入茎瘤固氮根瘤菌中,通过激光共聚焦显微镜来观测被浸染的小麦组织,初步判断在小麦体内的定殖与分布;（2）将茎瘤固氮根瘤菌制成的包衣包裹小麦种子,大田种植。硝酸还原酶活性在拔节期处理显著性高于对照,期间对小麦固氮相关基因的表达和矿质元素的吸收有一定的促进作用。丙二醛含量在灌浆期处理显著性高于对照,在小麦快成熟过程中对抗逆性有一定的提高。多酚氧化酶和过氧化物酶活性处理和对照各时期之间差异不明显;（3）虽然茎瘤固氮根瘤菌是一种益生菌,但与小麦互作初期仍然会引发小麦的防卫反应。选取侵染初期1h,3h,6h,9h,12h,24h,48h的小麦根,用实时定量PCR检测pox,sams,sod等防卫基因的表达情况。pox分别在1h和9h显著性高于对照,而sams则在第24h才达到最大显著性差异。sod与pox和sams相比,处理反而在第1h小于对照,在第24h和48h达到最大显著性差异。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章: 文献综述
• 1.1 研究目的和意义
• 1.2 禾本科植物生物固氮的研究进展
• 1.2.1 联合固氮的机理
• 1.2.2 植物根围促生细菌的促生作用机制
• 1.2.3 PGPR 的生防机制
• 1.3 小麦生理指标的研究进展
• 1.3.1 多酚氧化酶
• 1.3.2 硝酸还原酶和过氧化物酶
• 1.4 绿色荧光蛋白的研究进展及应用
• 1.4.1 绿色荧光蛋白的结构及光谱特性
• 1.4.2 GFP 的应用现状
• 第二章 pGEX-4T-EGFP 重组质粒的构建
• 2.1 实验材料、所用仪器
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 酶与试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 重组载体构建
• 3）'>2.2.2 重组载体转化克隆菌株BL21（DE₃）
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 EGFP 全长基因的PCR 扩增
• 2.3.2 重组质粒pGEX-4T-EGFP 构建示意图
• 2.3.3 重组质粒的双酶切鉴定
• 2.3.4 SDS-PAGE 检测EGFP 的表达
• 2.4 讨论
• 第三章 茎瘤固氮根瘤菌对大田小麦生理指标的影响
• 3.1 实验材料、所用仪器和试剂
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 仪器设备
• 3.1.3 主要试剂及配置方法
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 硝酸还原酶活性测定
• 3.2.2 多酚氧化酶活性测定
• 3.2.3 丙二醛含量测定
• 3.2.4 过氧化物酶活性测定
• 3.3 结果分析
• 3.3.1 茎瘤固氮根瘤菌对小麦硝酸还原酶活性的影响
• 3.3.2 茎瘤固氮根瘤菌对小麦多酚氧化酶活性的影响
• 3.3.3 茎瘤固氮根瘤菌对小麦丙二醛含量的影响
• 3.3.4 茎瘤固氮根瘤菌对小麦过氧化物酶的影响
• 3.4 讨论
• 第四章 茎瘤固氮根瘤菌诱导小麦根防卫基因的表达
• 4.1 实验材料和所用仪器
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 菌株
• 4.1.3 主要仪器
• 4.1.4 定量PCR 引物
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 小麦的限菌培养
• 4.2.2 总RNA 的提取纯化及cDNA 的合成
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 根防卫反应中茎瘤固氮根瘤菌对过氧化物酶（pox）基因的影响
• 4.3.2 根防卫反应中茎瘤固氮根瘤菌对 S-腺苷甲硫氨酸合成酶（sams）基因的影响
• 4.3.3 根防卫反应中茎瘤固氮根瘤菌对超氧化物歧化酶（sod）基因的影响
• 4.4 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介