论文摘要
胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ES cells）是从早期胚胎内细胞团或桑椹胚分离后,能在体外长期传代培养并保持高度未分化的全能细胞系。具有无限的分化潜能是其突出特点之一,即给予合适的培养条件,ES细胞可在体外分化为外、中、内胚层的任何类型类细胞。研究证明利用形成拟胚体（embryoid bodies,EBs）培养,三胚层结构可通过细胞因子和信号网络相互诱导分化形成肝细胞,重演体内肝脏的发育过程,分化得到的肝细胞具有体内正常肝细胞或原代培养肝细胞的特征和功能:（1）在肝细胞分化之前形成EBs具有典型的三胚层结构;（2）在ES细胞分化过程中,时空依赖性地表达肝细胞特异性转录因子和肝细胞特异基因;（3）分化得到的肝细胞具有典型的双核表型,并能合成和分泌白蛋白和尿素等;（4）分化得到的肝细胞表达微粒体Ⅰ相代谢酶并具有活性;（5）分化得到的肝细胞成功应用于CCl4毒性研究,具有应用于药物毒性初筛的前景。正是因为这些特征,ES细胞体外分化为肝细胞在下列领域的研究前景被逐渐引起关注:肝脏发育研究模型;药物代谢和药效毒性研究模型;肝脏衰竭的细胞治疗和组织工程中应用。鉴于ES细胞的上述应用前景,有必要对ES细胞分化的肝细胞功能特征作全面深入研究。其中代谢功能是肝细胞极其重要的特征,通过代谢可以将内源性和外源性化学物质排出体外,起到排毒解毒维持内环境稳定的作用。但迄今关于ES细胞分化肝细胞代谢酶研究的报道甚少,尤其未见关于微粒体Ⅱ相酶表达及其活性的报道。另由于ES细胞分化的肝细胞应用于药物研究,与其它来源细胞（原代肝细胞,HepG2肿瘤来源永生化细胞）相比,具有在功能上比较完善而且实验维持时间长的独特优势,因此本研究构建由ES细胞分化的肝细胞,并探索其是否具有微粒体Ⅱ相代谢酶的功能,为药物代谢研究的替代模型等提供依据。第一部分小鼠ES细胞分化肝细胞表型及功能的时程研究目的:构建ES细胞体外分化为肝细胞平台技术,为研究其代谢酶表达及功能提供实验体系。方法:采用ES细胞悬滴培养分化技术,形成EBs后,不添加任何诱导因子分化形成肝细胞。用RT-PCR法检测ES细胞分化肝细胞过程的发育依赖性基因的表达;免疫细胞化学法检测肝细胞表型及特异性标记物白蛋白（albumin,ALB）表达;用ELISA法检测分化得到肝细胞上清液的白蛋白含量,以评价其合成和分泌功能。结果:随着ES细胞分化时程,呈下述典型发育依赖性特征。RT-PCR结果显示,未分化特征基因OCT3/4的表达迅速下降,分化至d 18完全消失;未成熟肝细胞特征基因（α-fetoprotein,AFP）在分化中先增加后下降的趋势,至d 18仅见少量表达;标志成熟肝细胞特征基因ALB在分化过程中逐渐增加;而肝细胞代谢成熟特征基因Cyp7a1在分化d 18时有表达,表示在基因层面,ES细胞分化形成成熟肝细胞。免疫荧光检测显示呈典型的肝细胞双核结构,特异性标记物ALB呈阳性表达,提示已分化形成成熟肝细胞。通过ELISA法检测到ES细胞分化肝细胞在分化d8出现白蛋白的分泌,随着肝细胞进一步发育成熟,白蛋白含量逐渐递增,d 18达到平台期,提示所分化的肝细胞具备成熟肝细胞的分泌功能。结论:采用ES细胞悬滴培养分化技术,d 18时显示呈典型的肝细胞双核结构,特异性标记物ALB呈阳性表达,白蛋白含量逐渐递增达到平台期,提示已分化为成熟肝细胞。第二部分微粒体Ⅱ相代谢酶在ES细胞分化为肝细胞中的表达目的:探索ES细胞分化为肝细胞过程中,若干微粒体Ⅱ相酶基因及蛋白的表达,为研究其代谢功能提供依据。方法:ES细胞分化为肝细胞过程中,用RT-PCR法检测Ⅱ相代谢酶UGT1a1、UGT1a6、UGT1a9、UGT2b5和mGST1基因表达;用western-blot法检测UGTa1、UGT1a6、mGST1蛋白表达。结果与结论:在ES细胞分化为肝细胞过程中,基因转录结果显示,UGT1a1和UGT1a9表达较稳定;UGT2b5在分化过程中未见表达;UGT1a6和mGST1的表达呈上升趋势。蛋白表达则显示UGT1a1呈上升趋势;UGT1a6和mGST1在分化早期和中期表达甚微,在分化d 18有较高表达。提示在分化d 18的肝细胞已经具有Ⅱ相代谢酶代谢功能的物质基础。第三部分微粒体Ⅱ相代谢酶在ES细胞分化肝细胞中的代谢功能研究目的:探索分化成熟的肝细胞若干微粒体Ⅱ相代谢酶的代谢功能,为药物代谢研究提供实验模型,并为肝脏干细胞治疗可行性提供实验依据。方法:分化成熟的肝细胞用细胞超声仪破碎后,加入UGTs特异性底物UDPGA和7-HFC,经体外孵育法反应,用HPLC法检测7-HFC代谢后产物,以此确定UGTs活性;加入mGST1特异性底物CDNB与GSH,以CDNB与GSH结合形成复合物的变化测定分化成熟肝细胞中mGST1的催化活性。结果与结论:HPLC测定结果显示,ES细胞UGTs的代谢活性仅为0.069nmol/min/mg,但分化至d 18呈成熟肝细胞表型时,UGTs的代谢活性提高到0.445nmol/min/mg,约为未分化ES细胞的6倍。mGST1的催化活性为7.65nmol/min/mg。提示在ES细胞分化为成熟肝细胞中,具有UGTs和mGST1的代谢功能。以上实验表明:1.通过悬滴培养形成具有三胚层结构的EBs,能分化为成熟肝细胞表型并具有白蛋白合成分泌功能。2.在ES细胞分化为成熟肝细胞过程中,微粒体Ⅱ相代谢酶UGTs和mGST1的表达呈发育依赖性。3.ES细胞分化成熟的肝细胞表达的UGTs和mGST1具有代谢功能。