大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）分化为表皮细胞及皮损修复的实验研究

论文摘要

目的:探讨骨髓间充质干细胞利用特定的诱导剂体外诱导分化为表皮细胞的可能性及MSCs单独或与必要的诱导剂组合移植修复皮肤创面缺损与重建表皮的实验研究,为临床应用骨髓间充质干细胞移植治疗大面积烧伤等疾病提供实验依据。方法:1.大鼠间充质干细胞（MSCs）的分离培养、扩增与鉴定:取健康0.2kg左右Wistar大鼠一只,麻醉后在无菌的条件下取股骨和胫骨,剪断骨骺端,用无血清DMEM培养基冲出骨髓腔中的细胞后,用淋巴细胞分离液（比重1.077g/ml）密度梯度离心法分离单个核细胞（MNC）,以含10%胎牛血清DMEM培养基洗涤2次,以1×105cells/cm2密度接种于培养瓶孵育。2天后半量换液,4天时完全换液,弃去未贴壁细胞,贴壁细胞继续培养,以后每2-3天换液1次,14天后当细胞融合达80%左右时,用胰蛋白酶消化传代。定期观察细胞的生长情况,细胞传至第4代后用流式细胞仪分析CD34、CD29、CD90、CD45的表达情况,从而鉴定间充质干细胞。2. MSCs诱导分化成表皮细胞及其鉴定:将第4代细胞按106的密度接种于6孔培养板中,用含20%的烧伤大鼠血清的DMEM-F12培养基孵育,每3-4天换液一次,当细胞达到90%融合时,用胰蛋白酶消化传代,于第14天用免疫细胞化学染色及流式细胞仪检测细胞角蛋白（CK）阳性细胞即表皮细胞的表达情况。3.动物移植实验:动物模型制备及诱导后的MSCs与未经诱导的MSCs回植选取24只健康Wistar大鼠,平均体重为200g,雌雄各半,分为三组,每组八只,即治疗组A（经诱导的MSCs组）、治疗组B（未经诱导的MSCs组）和对照组C（无MSCs移植组）;大鼠背部正中线处,各制造直径约为5cm的圆形全层皮肤缺损创面,立即以Ⅰ型胶原为载体,将BrdU标记的自体MSCs及含有经诱导的MSCs分别单次涂布到治疗组A、B的创面上,而对照组C组仅在创面上涂布Ⅰ型胶原,各组创面上均敷凡士林纱布,然后采用打包法进行缝合固定后单笼饲养。4.创面观察接种后,切观察创面情况,于术后第14天将创面大小描印于无菌透明薄膜上,按公式计算创口收缩率,记录治疗组和对照组愈合时间。创口收缩率（ %） =闭合创面面积/原创面面积×100 %5.病理学及免疫组织化学染色检查于4周后选择实验动物,取创面中央直径1cm范围的皮肤,制成石蜡切片,用苏木精-伊红染色法（HE染色）染色,光镜下观察皮肤结构。同时,连续切片,采用SABC免疫组化检测。严格按博士德公司试剂盒说明书操作,二氨基联苯胺（DAB）显色。鼠抗BrdU单克隆抗体（北京中衫金桥生物公司）工作浓度1∶100 ,二抗羊抗鼠抗体工作浓度1∶100。于显微镜下观察染色结果,细胞核呈棕黄色的细胞为BrdU阳性细胞。结果:1. MSCs的分离培养、扩增与鉴定:细胞接种4天后首次完全换液,弃去未贴壁的细胞,贴壁的细胞即为MSCs,此细胞形态长梭形,类似成纤维细胞,呈团、簇状分布。14天时细胞贴满瓶底,此时呈鱼群样、漩涡状、辐射状或网状排列。传代后细胞增殖迅速,一般2-3天可传一代。流式细胞术分析MSCs结果显示,CD34表达率为2.65±0.56%、CD29表达率为96.87±2.54%、CD90表达率为90.37±3.55%、CD45表达率为1.62±0.16%。2.表皮细胞的鉴定:经20%的烧伤大鼠血清诱导MSCs14天后,用流式细胞仪检测细胞角蛋白（cytokeratin CK）阳性细胞即表皮细胞的表达率为7.22%,而未经诱导的CK阳性细胞的表达率为0.23%。同时,按免疫组化方法染色,检测胞浆呈棕黄色的CK阳性细胞即为表皮细胞。3.创面观察:术后两组创面均较干燥,面积逐日缩小,无明显感染征象.术后第14天治疗组A创面平均收缩率为78.2%±9.8%、治疗组B创面平均收缩率为79.1%±10.4%,对照组C创面平均收缩率为70.7%±10.2%,各两组间（A组与C组、B组与C组）均有显著性差异（P<0.05）,而两治疗组间（A组与B组）差距无显著性（P>0.05）;创面平均愈合时间分别是治疗组A为15.4%±0.9d,治疗组B为16.0%±1.2d,对照组C为19.5±1.0d,各两组间（A组与C组、B组与C组）均有显著性差异（P<0.05）,而两治疗组间（A组与B组）无显著性差异（P>0.05）。4. MSCs单独或与诱导剂组合移植皮肤再生作用比较:（1）常规病理学观察:在第4周三组再生皮肤病理切片中,治疗A、B组再生皮肤附件明显丰富,表皮细胞数目显著增多,细胞层次增多,表皮层明显增厚。（2）免疫组织化学染色结果:在第4周治疗A、B组再生皮肤组织切片中均可见BrdU染色阳性细胞,阳性细胞多位于皮肤附件毛囊内层上皮根鞘以及再生表皮的基底层、棘层,在形态学上此类细胞呈立方形或多边形,与周围表皮细胞无明显差异,且可见其相邻生长。结论:1.骨髓间充质干细胞经烧伤大鼠血清诱导后,可以向表皮细胞方向分化,说明骨髓间充质干细胞在特定诱导剂作用下,具有向外胚层组织细胞分化的潜能。2.比较MSCs单独移植组和与必要的诱导剂组合移植组,其皮肤创面在平均收缩率、平均愈合时间方面均无统计学差异。3.无论是MSCs单独移植还是与必要的诱导剂组合移植其皮肤的修复与再生情况都超过大鼠皮肤自然愈合,且不仅皮肤再生快,而且皮肤附件如毛囊等的再生也比对照组明显改善,为临床上MSCs用于移植治疗大面积严重烧伤等疾病提供了实验依据（即:既要有取材方便的皮源,又能使再生创面较快生长且接近正常皮肤功能）。

论文目录

• 一、正文
• （一） 中文摘要
• （二） 英文摘要
• （三） 前言
• （四） 第一部分 骨髓 MSCs 向表皮细胞诱导分化
• 材料与基本方法
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• （五） 第二部分 大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs） 单独或与 诱导剂组合移植修复皮损的研究
• 材料与基本方法
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• （六） 结论
• （七） 参考文献
• 二、文献综述
• （一） 综述
• （二） 参考文献
• 三、致谢