苹果玻璃化试管苗的特征特性、形成原因及DNA的MSAP分析

论文摘要

以苹果品种鲁加5号试管苗为试材,以石蜡切片和电镜扫描观察方法,比较了玻璃化与正常试管苗叶片和茎的显微结构；运用常规生理实验方法对玻璃化试管苗的生理特性进行测定；同时运用正交设计探讨了玻璃化现象发生的主要因素；最后运用分子生物学MSAP技术对玻璃化试管苗的DNA甲基化水平进行统计。得到以下结果：1与苹果正常试管苗相比,苹果玻璃化试管苗叶片和茎的显微结构与正常试管苗的均有显著差异,苹果玻璃化试管苗叶片的厚度变大,表皮细胞密度极低；表皮细胞体积膨大,液泡化,栅栏组织厚度减少,海绵组织厚度增加；气孔器长轴变化不明显,短轴变宽,气孔密度极高；茎的维管组织中有空洞和塌陷,导管管壁多皱褶,筛管中无淀粉粒积累。2苹果玻璃化试管苗的生理特性与正常试管苗有显著差异。与正常试管苗相比,苹果玻璃化试管苗叶片的组织总含水量显著增加,自由水含量增加43.26%,束缚水含量降低52.47%；叶绿素含量减少45.60%,膜透性增大35.43%,可溶性蛋白含量降低38.48%; SOD、POD、CAT活性均有不同程度的降低；ZT和GA3含量几乎没有差别,IAA含量增加14.66%,ABA含量降低29.00%。3气孔宽度在琼脂,蔗糖,大量元素以及光照的三水平（从低到高）下都有先减小再增大的趋势,其中影响力最大的因素（主效因子）为琼脂浓度,其次为光照强度；影响力最小的为大量元素。最适合苹果试管苗生长而不易发生玻璃化的培养基为：琼脂浓度为8 g.L-1,蔗糖浓度为30g·L-1,大量元素的量为3/4MS,光照强度为2000LX；最易发生玻璃化的培养基为：琼脂浓度为6.5 g-L-1,蔗糖浓度为25 g·L-1,大量元素的量为1/2MS,光照强度为1000LX。4在玻璃化与正常试管苗中扩增的条带数分别为303、308,其中甲基化条带总数分别为149、97,完全甲基化条带数分别为56、51,半甲基化条带总数分别为93、46；甲基化条带占总数的比例分别为49.2%、31.5%,完全甲基化条带占甲基化条带的总数的比例为37.6%、52.6%,半甲基化条带数占总的甲基化条带数的比例为62.4%、47.4%。根据玻璃化到正常苹果试管苗的甲基化带型的变化分为不变型（A）、减少型（B）、增加型（C）与不确定型（D）。类型A有39条,占甲基化条带数的比例为20.00%；类型B有43条,占甲基化条带数的比例为22.05%；类型C有93条,占甲基化条带数的比例为47.70%；类型D条带数20,占甲基化条带数的比例为10.25%。所以,甲基化程度的增加可能与苹果试管苗的玻璃化密切相关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 前言
• 文献综述
• 1 试管苗玻璃化的研究进展
• 2 DNA甲基化研究进展
• 3 MSAP技术在植物抗逆性方面的应用
• 研究内容
• 1 苹果玻璃化与正常试管苗叶片与茎的显微结构的比较
• 1.1 材料与方法
• 1.2 结果与讨论
• 1.2.1 试管苗的外观形态和叶片横切面结构特征
• 1.2.2 叶片的上表皮结构特征
• 1.2.3 叶片的下表皮结构特征
• 1.2.4 茎横切面的结构特征
• 2 苹果玻璃化试管苗生理特性的研究
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 生理生化指标的测定
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 苹果玻璃化与正常试管苗的叶片组织含水量的比较
• 2.2.2 苹果玻璃化与正常试管苗的叶绿素、膜透性和可溶性蛋白含量的比较
• 2.2.3 苹果玻璃化与正常试管苗的SOD、POD与CAT酶活性的比较
• 2.2.4 玻璃化与正常试管苗内源激素含量的比较
• 2.3 讨论
• 3 影响苹果试管苗玻璃化的主效因子的探讨
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 叶片下表皮的电镜扫描
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 琼脂浓度,蔗糖浓度,大量元素以及光照强度的正交设计的极差分析
• 3.2.2 琼脂浓度,蔗糖浓度,大量元素以及光照强度的正交设计的方差分析
• 3.3 讨论
• 4 苹果玻璃化与正常试管苗DNA的MSAP分析
• 4.1. 试验材料
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 苹果正常与玻璃化试管苗的叶片基因组DNA的提取
• 4.2.2 基因组DNA纯度和浓度的检测
• 4.2.2.1 琼脂糖凝胶电泳检测
• 4.2.2.2 紫外分光光度计检测
• 4.2.3 MSAP技术反应体系的建立
• 4.2.3.1 接头与引物的设计
• 4.2.3.2 酶切反应体系的建立
• 4.2.3.3 连接反应体系的建立
• 4.2.3.4 预扩反应体系的建立
• 4.2.3.5 选扩反应体系的建立
• 4.2.4 PAGE变性凝胶电泳
• 4.2.4.1 玻璃板的准备
• 4.2.4.2 凝胶的制备
• 4.2.4.3 灌胶
• 4.2.4.4 电泳槽的装配
• 4.2.4.5 预电泳
• 4.2.4.6 电泳
• 4.2.4.7 银染
• 4.3 结果与分析
• 4.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表文章
• 致谢