植物病原卵菌RXLR效应蛋白Avr1b互作蛋白的初步筛选

论文摘要

卵菌（Oomycetes）包括疫霉菌、霜霉菌、腐霉菌等,大多都是重要的植物病原菌,在世界范围内,给许多农作物和花卉植物带来毁灭性危害。大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）是卵菌遗传学和病理学研究的重要模式种,引致重要农作物大豆的疫霉根腐病。研究植物与病原卵菌互作的分子机制,从分子水平上揭示植物的抗病机理,对卵菌类病害的有效防治具有重要的意义。在植物-病原互作过程中,病原菌的效应基因编码产物被植物识别时被称为无毒基因。病原卵菌编码一大类被称为RXLR的效应蛋白,在其信号肽序列下游含有保守的RxLR-dEER结构域。RXLR效应蛋白在卵菌致病过程中起关键的作用。大豆疫霉菌（ P. sojae ）的Avr1b基因在大豆疫霉菌与大豆互作中,除了被抗病基因Rpslb识别而激活植物抗病反应外,在不被识别的情况下还具有重要的毒性功能。本研究以实验室成功构建的寄生疫霉菌（P. parasitica）休止孢萌发阶段以及侵染拟南芥阶段的病组织cDNA文库为材料,利用酵母双杂交方法筛选鉴定与Avr1b互作的蛋白。采用PCR扩增获得Avr1b目的基因,克隆到酵母双杂交系统诱饵载体pGBKT7,构建诱饵载体pGBKT7-mAvr1b。通过cDNA文库（约2×107cDNA克隆）筛选并经共转化反复验证确定了12个与Avr1b互作的候选蛋白。为了进一步研究Avr1b效应蛋白可能的植物靶标,经拟南芥同源序列比对,确定了同源程度较高的6个拟南芥基因序列。对其中4个候选植物靶标基因的进一步分析,获得与Avr1b效应蛋白互作的2个植物靶标蛋白。本项研究为进一步研究Avr1b效应蛋白的转运和在寄主植物细胞中的作用机理奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 卵菌的危害
• 1.1.1 植物病原卵菌与植物互作的研究
• 1.1.2 大豆疫霉菌的研究现状
• 1.2 病菌效应蛋白毒性靶标的研究进展
• 1.2.1 基因对基因假说
• 1.2.2 卵菌RXLR 效应蛋白研究概况
• 1.2.3 无毒基因Avr1b
• 1.2.4 效应蛋白毒性靶标
• 1.3 模式植物拟南芥研究概况
• 1.4 酵母双杂交研究进展
• 1.4.1 酵母双杂交系统的原理
• 1.4.2 酵母双杂交系统的优点及其局限性
• 1.4.3 酵母双杂交系统的用途及意义
• 1.5 本研究的理论基础
• 1.6 本研究的目的和意义
• 第二章 诱饵载体PGBKT7-Avr1b 的构建及鉴定
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株及载体
• 2.1.2 寄生疫霉菌休止孢萌发阶段以及侵染拟南芥阶段的病组织cDNA 文库
• 2.1.3 主要试剂及仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 实验所用引物
• 2.2.2 PCR 扩增目的片段mAvr1b
• 2.2.3 目的片段胶回收
• 2.2.4 目的片段及诱饵载体pGBKT7 酶切
• 2.2.5 转化大肠杆菌及酶切检测
• 2.2.6 重组质粒测序鉴定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 诱饵载体构建结果
• 2.3.2 诱饵载体测序结果
• 2.4 讨论
• 第三章 效应蛋白Avr1b 的植物靶标的初步筛选
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.2.1 酵母感受态细胞的制备
• 3.2.2 诱饵蛋白的自激活检测
• 3.2.3 诱饵蛋白的毒性检测
• 3.2.4 cDNA 文库的筛选
• 3.2.5 酵母质粒提取
• 3.2.6 共转化验证
• 3.2.7 RT-PCR 扩增靶标基因
• 3.2.8 靶标载体的构建
• 3.2.9 共转化验证蛋白间相互作用
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 诱饵质粒自激活检测
• 3.3.2 诱饵蛋白毒性检测结果
• 3.3.3 Mating 方法筛选cDNA 文库结果
• 3.3.4 共转化方法回转验证
• 3.3.5 反复验证得到阳性候选靶标的序列分析结果
• 3.3.6 PCR 扩增靶标基因的结果
• 3.3.7 靶标载体的构建
• 3.3.8 诱饵蛋白与拟南芥植物靶标互作的共转化结果与分析
• 3.4 讨论
• 第四章 结论与创新点
• 4.1 结论
• 4.2 创新点
• 参考文献
• 附录
• 一、培养基配方
• 二、载体图谱
• 致谢
• 作者简介