猪链球菌基因SSU051000功能及猪链球菌2型抗吞噬机制的研究

论文摘要

猪链球菌血清2型（Streptococcus suis serotype 2）简写为SS2,是一种人畜共患病致病菌,具有极强的感染性。SS2感染人导致菌血症、链球菌中毒性休克综合征、脑膜炎等,我国在1998年及2005年两次爆发了猪链球菌感染疫情,分别导致14人和38人死亡。不同于国外人感染病例以脑膜炎为主的特点,我国死亡病例多为休克型,病例起病急,病情重,病程短,死亡率高,并且猪链球菌病无特效防治药物,因此对它的研究逐渐成为病原菌研究领域中的一个新的热点。现今国内外学者对猪链球菌的研究主要集中在毒力因子和保护性抗原筛选、致病机制研究、抗吞噬机制研究等方面。现今已经筛选出了大量猪链球菌的毒力因子如荚膜多糖（Capsular Polysaccharide,CPS）、溶血素（Suilysin,Sly）等,并且对其在侵染过程中起到的作用有了一定程度的了解；但是根据现有报道同样发现,这些毒力因子并不是绝对的,某些分离株不具有致病性,但是依然存在其中的某个或者某些毒力因子,这对找出一种SS2通用的致病机制产生了极大的困难。因此,寻找毒力因子并且深入研究其致病机制成为了重中之重。SSU051000是新发现的一个SS2胞壁蛋白,具有有极强的免疫原性,因此怀疑其在猪链球菌侵染过程中扮演了重要的角色,并且国内外对此蛋白的研究未见报道。本文对此因子毒力进行了评价,并且研究了其在抵抗免疫细胞杀伤方面的功能,具体结论如下：1 A1000SS基因缺失株、CA1000SS缺失互补株构建、验证及生物学现象分析以05ZYH33为出发菌株,用pSET-4S质粒作为载体,利用同源重组方法敲除基因SSU051000构建缺失突变株Δ1000SS；再以pAT18载体作为互补质粒成功构建Δ1000SS的基因互补菌株CA1000SS。之后对三种菌株分别进行竞争感染CDl小鼠实验、上皮细胞内皮细胞粘附实验、血中存活及增殖实验、中性粒细胞（Polymorphonuclear Neutrophil,PMN）杀伤实验。结果表明其竞争感染常数为0.531；Δ1000SS对上皮细胞HEP-2粘附率为5.37%（05ZYH33为8.23%）、内皮细胞HUVEC1.88%（05ZYH33为5.35%）；Δ1000SS血中存活率和增殖率分别为16.35%和2.98倍,相比05ZYH33的26.25%和4.30倍均有显著下降；PMN杀伤实验显示Δ1000SS存活率37.47%比05ZYH33的56.31%有显著下降。这些结果说明SSU051000与毒力相关,其在细菌定植及抗吞噬中起到重要作用。2 SSU051000在抵抗PMN吞噬机制中的功能研究2.1蛋白的核酸酶活性验证首先对SSU051000蛋白进行了原核表达及纯化,经过条件优化可以使蛋白纯度达到75%以上。根据Sanger中心（www.sanger.ac.uk）标注,此蛋白具有核酸酶活性；但是经核酸降解实验发现无论是经过蛋白处理或是菌体处理过的核酸样品均未发现明显的降解现象,其核酸酶活性应不存在,因此推测蛋白在中性粒细胞胞外陷阱（Neutrophil Extracellular Traps, NETs）机制中应没有作用。2.2血浆中与SSU051000互作蛋白钓取及互作验证将SSU051000蛋白固定后进行His Pull-Down实验钓取到了与之结合的血浆蛋白纤维蛋白原。由于His Pull-Down实验容易出现假阳性结果,因此首先验证二者结合是否为真阳性。利用ELISA实验、Far Western Blot实验,流式细胞实验均可验证SSU051000与Fg有结合；最终用PMN杀伤实验研究蛋白结合后是否有功能,发现在外源性添加了2 mg/mL Fg或者直接加入20%血浆之后05ZYH33存活率由60.23%分别上升至72.61%和78.67%,Δ1000SS在有Fg与无Fg情况下明显有存活率的差异（血清中的40.21%和血清+Fg的63.03%、血浆中的70.88%）,这说明二者之间能够结合并且有一定程度的互作,但是此两种蛋白的互作不是SSU051000蛋白产生抗吞噬作用的主要原因。2.3补体沉积实验研究SSU051000在抗吞噬机制中的功能然后通过流式细胞实验分析了不同条件下SSU051000缺失后补体沉积变化,发现SSU051000缺失后补体C3b沉积量由64.74上升至139.16,前后差异显著；血清中加入特异性IgG之后Δ1000SS补体沉积量仅比05ZYH33高22.90%；利用无天然C3b血清进行补体沉积实验后发现05ZYH33和Δ1000SS补体沉积量分别从139.16和64.74下降至4.75和5.17,与阴性值2.07无差异。综上可以认为在无特异性IgG条件下PMN细胞杀伤SS2主要由旁路途经介导并且SSU051000具有抑制补体沉积的作用。本文通过对基因SSU051000的功能研究,揭示了它为SS2一个可能的毒力因子；本文建立了利用Pull-Down技术钓取互作蛋白的方法,并通过实验调取到了一个与猪链球菌表面蛋白互作的重要蛋白纤维蛋白原；并且通过研究二者相互作用以及SSU051000对补体补体沉积的影响初步揭示了SS2抗吞噬的机制,为今后的研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 第一章 文献综述
• 1 猪链球菌生物学性状及流行病学
• 2 猪链球菌毒力因子
• 2.1 多糖
• 2.2 蛋白类
• 2.2.1 溶菌酶释放蛋白和细胞外因子
• 2.2.2 溶血素
• 2.2.3 纤连蛋白结合蛋白
• 2.2.4 IgG结合蛋白
• 2.3 酶类
• 2.3.1 谷氨酸脱氢酶
• 2.3.2 ORF2毒力相关序列
• 2.3.3 转运基因G
• 2.3.4 转录调节因子
• 2.3.5 分泌型核酸酶
• 2.3.6 次黄嘌呤核苷酸脱氢酶
• 2.4 毒力岛
• 3 致病菌抵抗吞噬细胞杀伤机制的研究
• 4 目的及意义
• 第二章 Δ1000SS基因缺失株、CΔ1000SS缺失互补株构建、验证及菌株生物学现象分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株、质粒与细胞系
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.1.4 引物
• 1.1.5 实验动物
• 1.2 方法
• 1.2.1 生长条件及培养基配制
• 1.2.2 电转化猪链球菌
• 1.2.3 敲除突变体的筛选和鉴定
• 1.2.4 互补株的构建
• 1.2.5 敲除株、互补株验证
• 1.2.6 生长曲线测定
• 1.2.7 小鼠竞争感染实验
• 1.2.8 全血杀菌实验
• 1.2.9 血中增殖实验
• 1.2.10 细胞粘附实验
• 1.2.11 PMN杀伤实验
• 2 结果与分析
• 2.1 敲除菌株Δ1000SS的筛选
• 2.2 互补质粒pAT18-1000的构建
• 2.3 互补质粒转化及验证互补成功
• 2.4 RT-PCR验证互补质粒转录
• 2.5 Real-Time PCR验证RNA转录量
• 2.6 生长曲线测定
• 2.7 CD1小鼠竞争感染实验
• 2.8 全血杀菌实验
• 2.9 血中增殖实验
• 2.10 细胞粘附实验
• 2.11 PMN杀伤实验
• 3 小结与讨论
• 3.1 小结
• 3.2 讨论
• 1000在抵抗PMN吞噬机制中的功能研究'>第三章 SSU05₁000在抵抗PMN吞噬机制中的功能研究
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 菌株及质粒
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器及器材
• 1.2 方法
• 1.2.1 His-1000蛋白纯化
• 1.2.2 核酸降解实验
• 1000互作蛋白的钓取及互作验证'>1.2.3 血浆中与SSU05₁000互作蛋白的钓取及互作验证
• 1000在抗吞噬机制中的功能'>1.2.4 补体沉积实验研究SSU05₁000在抗吞噬机制中的功能
• 2 实验结果与分析
• 2.1 His-1000蛋白纯化
• 2.2 核酸降解实验
• 1000互作蛋白的钓取及互作验证'>2.3 血浆中与SSU05₁000互作蛋白的钓取及互作验证
• 1000结合蛋白'>2.3.1 His Pull-Down钓取与SSU05₁000结合蛋白
• 2.3.2 ELISA方法验证蛋白结合
• 1000与Fg结合'>2.3.3 Far WesternBlot验证SSU05₁000与Fg结合
• 1000与Fg结合'>2.3.4 流式细胞技术验证SSU05₁000与Fg结合
• 2.3.5 PMN杀伤实验验证蛋白互作
• 1000在抗吞噬机制中的功能'>2.4 补体沉积实验研究SSU05₁000在抗吞噬机制中的功能
• 2.4.1 流式细胞实验条件优化
• 2.4.2 经典补体途径验证
• 2.4.3 旁路途径验证
• 3 小结与讨论
• 3.1 小结
• 3.1.1 核酸降解实验
• 3.1.2 血浆中与1000互作蛋白的钓取及互作验证
• 1000在抗吞噬机制中的功能'>3.1.3 补体沉积实验研究SSU05₁000在抗吞噬机制中的功能
• 3.2 讨论
• 3.2.1 SS2抵抗NETs机制杀伤
• 3.2.2 Fg在SS2抵抗免疫细胞杀伤中可能的作用
• 第四章 结论与展望
• 1 结论
• 2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 附录Ⅰ 试剂盒操作步骤
• 附录Ⅱ 主要试剂的配制
• 附录Ⅲ 常用实验方法