腈水解酶基因克隆表达及应用研究

论文摘要

化学工业的规模和实力是衡量一个国家综合国力的一个重要指标。经过多年努力,我国精细化学品工业已具有相当的规模,在化学工业中占有很大的地位,部分产品的产量达到世界前列。但是,环境污染问题是目前我国精细化工产业面临的最大挑战,以破坏环境为代价发展经济并非长远之计,必须走化工生产绿色化和可持续发展道路。腈水解酶在有机合成重要中间体——有机羧酸的制备中有重要的应用价值。腈水解酶生物催化法制备有机酸具有高效性、高选择性、反应条件温和、环境污染小和产物光学纯度高等优点,符合原子经济型和绿色化学的发展方向,有着化学方法无可比拟的优越性。生物法生产亚氨基二乙酸符合绿色化学及可持续发展的要求,同时也是制备草甘膦除草剂的重要合成途径之一。本论文围绕构建基因工程菌来生产亚氨基二乙酸展开研究,通过同源建模、分子对接手段建立判断腈水解酶类型的方法,对筛选得到的腈水解酶进行结构和酶学性质的考察,从中获得一个高效制备亚氨基二乙酸的腈水解酶,然后在基因水平上对该腈水解酶进行了分子改造,提高转化率,为工业化生产奠定了基础。论文首先从NCBI数据库中挑选了 9条氨基酸序列差异较大的腈水解酶序列,利用软件进行密码子优化后全合成基因序列,接着将这些序列克隆到表达载体pET-28b中进行表达,利用亲和色谱柱对表达产物进行分离纯化,纯化后的目标蛋白达到电泳纯。通过对接实验的研究,初步建立了一种快速判断腈水解酶的方法,分析比较不同类型腈水解酶结构后,找到了重要氨基酸的位置。通过底物特异性的研究,我们选取己二腈作为共同底物,对这9个腈水解酶进行了酶学性质的研究,发现AcfN、KpN、GpN腈水解酶在40-60℃之间活力变化不大,具有良好的应用潜力,当温度高于70℃后,所有腈水解酶都基本丧失催化活性。大部分腈水解酶的最适催化pH要偏碱性一些,在pH7.0-8.0之间。当pH<3.0或>10.0时,腈水解酶的活力几乎丧失,这些腈水解酶的性质为规模放大后的实验设计提供了参考价值。在金属离子对腈水解酶酶学性质影响的研究中得出,当Ag+和Hg2-+存在时,所有腈水解酶的活力都小于等于10%的空白对照,这表明巯基基团在催化作用中具有重要作用。另外,Ca2+、Mg2+、Zn2+小幅提高部分腈水解酶活力。EDTA对腈水解酶基本没有抑制作用,表明腈水解酶在催化时不需要2价金属离子的参与。最后,在9个不同腈水解酶的酶学性质研究的基础上,挑选出腈水解酶AcfN,研究其催化亚氨基二乙腈生产亚氨基二乙酸的反应进程。通过对重要氨基酸的突变,突变后的腈水解酶转化率大于95%,分析了其可能的催化机制,从而验证了结构分析的结果。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 腈化合物与腈水解酶概述
• 1.1.1 腈水解酶的来源和分类
• 1.1.2 腈水解酶的结构及其酶的作用机制
• 1.1.3 腈水解酶基因克隆与表达
• 1.2 腈水解酶的应用
• 1.2.1 腈水解酶的立体选择性
• 1.2.2 腈水解酶的区域选择性
• 1.2.3 腈水解酶在有机合成方面的应用
• 1.2.4 腈水解酶在生物降解方面的应用
• 1.3 腈水解酶在生产草甘膦方面的应用
• 1.3.1 草甘膦的生产方法和用途
• 1.3.2 亚氨基二乙酸的其他应用
• 1.3.2.1 鳌合剂
• 1.3.2.2 回收以及精制有价值的金属
• 1.3.2.3 增光剂与缓凝剂
• 1.3.2.4 分离纯化剂
• 1.3.2.5 表面活性剂
• 1.3.2.6 其他应用
• 1.3.3 腈水解酶用于生产亚氨基二乙酸
• 1.4 结语与展望
• 1.5 本论文的研究内容
• 参考文献
• 第二章 腈水解酶基因的结构分析,克隆表达与分离纯化
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.1.1 菌种与质粒
• 2.2.1.2 培养基
• 2.2.1.3 工具酶
• 2.2.1.4 试剂
• 2.2.1.5 主要实验仪器
• 2.2.2 实验方法
• 2.2.2.1 腈水解酶基因的筛选与基因的获得
• 2.2.2.2 腈水解酶基因的克隆
• 2.2.2.3 电泳检测PCR产物
• 2.2.2.4 目的基因与表达载体的连接
• 2.2.2.5 重组表达质粒的构建
• 2.2.2.6 大肠杆菌E.coliJM109感受态的制备及转化程序
• 2.2.2.7 碱裂解法提取质粒
• 2.2.2.8 大肠杆菌E.coli BL21（DE3）感受态的制备及转化程序
• 2.2.2.9 重组质粒的序列测定
• 2.2.2.10 诱导表达,分离纯化与SDS-PAGE分析
• 2.2.2.11 腈水解酶的同源建模与分子对接
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 腈水解酶基因序列的筛选
• 2.3.2 腈水解酶的原核表达载体的构建
• 2.3.3 腈水解酶的分离纯化
• 2.3.4 SDS-PAGE检测
• 2.3.5 腈水解酶序列、结构分析与催化机制分析
• 2.3.5.1 腈水解酶的模拟结构
• 2.3.5.2 腈水解酶的分类
• 2.3.5.3 不同类型腈水解酶三维结构比较
• 2.3.5.4 不同类型腈水解酶三维结构的比较
• 2.4 本章小结
• 参考文献
• 第三章 腈水解酶酶学性质的研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌种与培养基
• 3.2.2 主要仪器和试剂
• 3.2.3 腈水解酶的制备
• 3.2.4 检测方法的建立及酶活单位的定义
• 3.2.5 pH对酶活的影响
• 3.2.6 温度对酶活的影响
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 腈水解酶底物特异性研究
• 3.3.2 反应温度对酶活的影响
• 3.3.3 最适催化pH
• 3.3.4 金属离子与化学试剂对催化活力的影响
• 3.4 本章小结
• 参考文献
• 第四章 重组腈水解酶及突变体在生物法制备亚氨基二乙酸中的应用
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌种与培养基
• 4.2.2 主要仪器和试剂
• 4.2.3 腈水解酶的制备
• 4.2.4 检测方法的建立,酶活单位的定义
• 4.2.5 细胞破碎以及游离酶的获得
• 4.2.6 AcfN腈水解酶及突变蛋白的分离纯化
• 4.2.7 粗酶液总蛋白含量的测定
• 4.2.8 催化亚氨基二乙腈产亚氨基二乙酸的反应进程研究
• 4.2.9 腈水解酶突变菌株的构建
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 亚氨基二乙酸的标准曲线
• 4.3.2 不同腈水解酶对亚氨基二乙腈的活力比较
• 4.3.3 AcfN的分离纯化
• 4.3.4 产亚氨基二乙酸的反应进程
• 4.3.5 AcfN腈水解酶突变蛋白的活力测定
• 4.3.6 AcfN腈水解酶结构分析
• 4.4 本章小结
• 参考文献
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 攻读硕士学位期间发表的论文情况
• 致谢