兔卵巢组织慢速冷冻和玻璃化冷冻保存方法的研究

论文摘要

研究背景良、恶性肿瘤的治疗,尤其是放、化疗会导致女性卵巢功能受损而出现月经不规律、卵巢早衰和不孕。肿瘤治疗前先将卵巢组织进行冷冻,可以保存大量卵泡,复苏后自体移植可为卵巢早衰患者提供恢复生育能力及内分泌功能的可能性。目前,程序化冷冻是卵巢组织冷冻常用方法,现已有将冻存的卵巢组织复苏后移植获得健康婴儿的报导。但是程序化冷冻存在一些难以克服的问题。首先,冷冻和复苏时两次冰晶形成,增加了损伤的机会,溶液效应和渗透性休克没有彻底解决；其次,对于卵巢这种含有多种细胞、复杂的间质成分甚至血管系统的组织,采用传统慢速冷冻方法,降温速度和最佳植冰温度很难同时满足各种细胞成分的需要。而且程序冷冻耗时多,需要昂贵的程序冷冻仪。玻璃化冷冻是近年来出现的一种新型冷冻方法,该方法使用高浓度的冷冻保护剂,将冷冻对象直接投入液氮中,在急速降温过程中,溶液从液态转化成一种无冰晶的玻璃化固态,可以最大程度避免冰品形成对细胞膜及细胞骨架结构的损伤,保留细胞内外液体正常的分子和离子分布。而且玻璃化冷冻具有操作简便,无需精密仪器控温等特点。此过程中所使用的载体系统能否达到足以形成玻璃态的降温速度是决定玻璃化冷冻效果的重要因素。迄今为止,玻璃化冷冻技术中常采用的载体包括冷冻管、开放式拉长细管、电镜用铜网、Cryoloop以及铝箔片等。但是究竟哪种载体更适合用于卵巢组织的玻璃化冷冻尚无定论。目的比较慢速冷冻、冷冻管玻璃化冷冻和固相表面玻璃化冷冻对兔卵巢组织的保存效果。方法15只新西兰雌兔进行双侧卵巢切除,取卵巢皮质切块后,切割为2-3mm×1mm×1mm的组织块,随机分成5组：①新鲜组（F组）；②二甲亚砜慢速冷冻组（DMSO组）；③丙二醇慢速冷冻组（PROH组）；④冷冻管玻璃化冷冻组（TV组）；⑤固相表面玻璃化冷冻组（SSV组）。各试验组分别冷冻后在液氮中保存48小时后快速复苏。F组、冻融后各试验组及培养后组织常规HE染色,用于组织学检查,观察各组卵泡形态,计数形态正常和异常的原始和初级卵泡,计算各组卵巢组织的原始和初级卵泡形态正常率。各组冻融后组织进行体外培养,隔天测定培养液中雌二醇水平,比较冻融后卵巢组织的内分泌功能。通过TdT介导的dUTP缺口末端标记技术,检测细胞凋亡情况。结果F组和各冷冻组在光镜下均可见到形态正常和闭锁的卵泡。大多数原始和初级卵泡解冻后保持了正常的形态。与F组相比,DMSO、TV组原始卵泡正常形态率降低,差别有统计学意义（P<0.05）,PROH、SSV组原始卵泡正常形态率差别无统计学意义（P>0.05）。5组间初级卵泡正常形态率差别无统计学意义（P>0.05）。培养14d后,可观察到组织粒直径变大,光镜下观察各组均可见到存活卵泡,颗粒细胞肥大。各实验组原始卵泡形态正常率均低于A组（P<0.001）；各实验组间的差别无统计学意义（P=0.988）；5组间初级卵泡形态正常率无明显差异（P=0.165）。与F组相比,DMSO、PROH、SSV组的培养组织中的初级卵泡比例均明显增加（P<0.05）,TV组与F组的差异不明显（P=0.139）。体外培养过程中,培养液雌二醇水平不断增加（P<0.001）,慢速冷冻较玻璃化冷冻的雌二醇平均浓度高,差别有统计学意义（P=0.021）。细胞凋亡检测显示,无论是原始卵泡还是初级卵泡,与F组相比,各实验组的卵泡凋亡率均无显著性差异（P>0.05）。结论程序化冷冻和固相表面玻璃化冷冻均能很好的保存兔卵巢组织中大部分的原始卵泡和初级卵泡,而且经过体外培养,能保持一定的内分泌功能。程序化冷冻中,使用DMSO和PROH作为冷冻保护剂,对于原始卵泡和初级卵泡的保护作用相当。将固相表面玻璃化法应用于兔卵巢组织冷冻,效果明显优于冷冻管玻璃化法。

论文目录

• 目录
• 中英文缩写词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料与方法
• 实验材料
• 1、实验动物
• 2、主要仪器与设备
• 3、主要试剂
• 4、卵巢组织冷冻液、解冻液和培养液的配制
• 实验方法
• 1、卵巢组织的获取
• 2、卵巢组织的预处理
• 3、卵巢组织的分组
• 4、卵巢组织的冷冻、解冻过程
• 5、解冻后兔卵巢组织的培养技术
• 6、组织学分析
• 7、卵泡的凋亡检测（TUNEL）
• 8、雌二醇的检测
• 9、统计学分析
• 结果
• 1、卵巢组织的组织学分析
• 2、解冻后兔卵巢组织的体外培养
• 3、体外培养中雌二醇的分泌
• 4、卵泡的凋亡率比较分析
• 讨论
• 一、卵巢组织冷冻保存的优势
• 二、卵巢组织冷冻保存及损伤的原理
• 三、卵巢组织冷冻保存的方法
• 四、卵巢组织的体外培养
• 五、卵巢组织冷冻前后细胞的凋亡情况
• 总结与展望
• 结论
• 附图
• 文献综述
• 参考文献
• 致谢