斑茅脯氨酸代谢关键基因Ea-δ-OAT和Ea-P5CS克隆及功能分析

论文摘要

斑茅（Erianthus arundinaceum）是甘蔗（Saccharum L.）近缘属植物之一,具有多种优良抗性,是甘蔗育种的重要种质资源。本文选甘蔗近缘属植物斑茅为研究材料,利用RT-PCR和RACE技术克隆了脯氨酸代谢过程中谷氨酸途径和鸟氨酸途径的关键酶基因δ-OAT和P5CS。利用实时荧光定量PCR技术对PEG、NaCl和ABA处理不同时间两个基因的表达进行分析,探讨脯氨酸积累过程中两条合成途径的主次关系,并试图理解不同处理情况下斑茅脯氨酸代谢与抗旱性的关系。从斑茅中分离出编码鸟氨酸-δ-氨基转氨酶基因（Ea-δ-OAT）全长cDNA序列1720bp,编码454个氨基酸,GenBank登录号为（EU113256）。通过同哺乳动物、高等植物、微生物的δ-OAT基因编码的氨基酸序列进行同源比对,发现斑茅Ea-δ-OA瑾因同其近缘属植物甘蔗的同源性最高（87%）,而同其他高等植物的同源性次之（约为70%）,同动物的同源性最低（约为60%）。在斑茅Ea-δ-OAT基因编码的氨基酸序列的5′端未发现线粒体定位序列,同甘蔗Sc-δ-OAT基因一样。斑茅Ea-δ-OAT基因具有完整的鸟氨酸转氨酶功能区rocD。所获得斑茅△1-吡咯啉-5-羧酸合酶基因（Ea-P5CS）cDNA全长2563bp,5′端非编码区103bp。包含一个2148bp编码716个氨基酸的开放读码框（ORF）,3′端非编码区312bp,poly（A）上游有1个聚腺苷酸五碱基AATAAA,GenBank登录号为（EU113257）。将基因编码氨基酸序列在GenBank中进行BLAST分析,发现其与近缘属植物甘蔗同源性达97%,与水稻同源性达87%。斑茅P5CS基因编码双功能的酶,N端含有1个谷氨酸激酶（G5K（ProB））功能区,在C端有一个谷氨酰半醛脱氢酶(glutamyl 5-phosphate reductase（G5PR,ProA）功能区。在不同胁迫处理（PEG、NaCl和ABA）下,对两个斑茅脯氨酸代谢关键基因的Q-PCR分析:将两个基因的Q-PCR分析结果归纳列出,然后说明那种途径起主要作用。结果表明,30%PEG胁迫下斑茅脯氨酸积累过程的两条代谢途径中,胁迫前期谷氨酸途径和乌氨酸途径同时在起作用,在胁迫后期谷氨酸途径逐渐占据主要位置;250mMNaCl胁迫下斑茅脯氨酸代谢过程中前6h脯氨酸的积累由谷氨酸途径和鸟氨酸途径共同调节,随后鸟氨酸途径占主导地位;10mg/L ABA处理下斑茅脯氨酸积累过程中,前期谷氨酸途径和鸟氨酸途径共同作用,鸟氨酸途径在后期占主导地位。斑茅中也存在两个编码P5CS的基因,且一个为ABA依赖型,一个为不依赖ABA型。所克隆的到的Ea-P5CS基因为不依赖ABA型。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 渗透调节对植物抗旱的影响
• 1.2 渗透调节物质及其代谢研究进展
• 1.2.1 脯氨酸同渗透调节的关系
• 1.2.2 其他渗透调节物质
• 1.3 渗透调节基因工程研究进展
• 1.4 本研究的目的意义与研究方案
• 1.4.1 目的意义
• 1.4.2 研究方案
• 2.材料与方法
• 2.1 植物材料
• 2.2 试剂载体及菌株
• 2.3 基因的克隆
• 2.3.1 斑茅总RNA提取
• 2.3.2 Ea-δ-OAT基因克隆策略
• 2.3.3 Ea-P5CS基因克隆策略
• 2.4 实时荧光定量PCR
• 3 结果与分析
• 3.1 斑茅Ea-δ-OAT基因的克隆与序列分析
• 3.1.1 斑茅Ea-δ-OAT基因3′端和5′端的获得
• 3.1.2 斑茅Ea-δ-OAT基因核苷酸序列分析
• 3.1.3 斑茅Ea-δ-OAT基因的系统进化分析
• 3.2 斑茅Ea-P5CS基因的克隆与序列分析
• 3.2.1 斑茅Ea-P5CS ORF的克隆
• 3.2.2 斑茅Ea-P5CS核苷酸序列及分析
• 3.2.4 斑茅Ea-P5CS基因的系统进化分析
• 3.3 不同胁迫下斑茅Ea-δ-OAT和Ea-P5CS基因的表达
• 3.3.1 目的基因和对照基因的标准曲线与扩增曲线
• 3.3.2 胁迫下斑茅Ea-δ-OAT和Ea-P5CS基因的表达量
• 4 讨论和结论
• 4.1 斑茅Ea-P5CS基因及其与脯氨酸代谢的关系
• 4.2 斑茅Ea-δ-OAT基因与脯氨酸代谢的关系
• 4.3 ABA在植物逆境胁迫下的作用及其与脯氨酸代谢的关系
• 4.4 结论
• 参考文献
• 附录
• 缩写词
• 已发表相关论文
• 致谢