乳清水解产物抗氧化活性研究

论文摘要

近年来,乳清综合利用及其功能性成为研究热点。乳清及其水解产物具有抗氧化活性。本研究应用碱性蛋白酶酶解、瑞士乳杆菌发酵等手段提高乳清的抗氧化活性,优化水解条件,探讨水解条件与水解产物抗氧化活性间的关系,并进一步通过动物实验验证水解产物的抗氧化活性,力求为综合开发利用乳清提供新思路。在确定了酸乳清的制备工艺及预处理方法的基础上,通过对酶解时间、酶解温度、酶解pH和酶与底物比（E/S）等条件的单因素和正交优化实验,得到碱性蛋白酶水解乳清制备抗氧化产物的最佳工艺如下：酶解温度为55℃、酶解3h、酶解pH8.5、E/S为2%,该条件下水解产物的羟自由基清除率为68.54%,而未添加碱性蛋白酶的乳清的羟自由基清除率为32.27%。证明了蛋白酶水解可以显著提高乳清的抗氧化活性。从酸乳中分离出了10株乳酸菌,并将其与瑞士乳杆菌、植物乳杆菌进行比较,筛选出了蛋白酶活性高的菌——瑞士乳杆菌。研究了瑞士乳杆菌发酵乳清制备抗氧化活性产物的发酵条件。通过对发酵时间、发酵温度、初始pH值和接种量的单因素和正交优化实验,得到瑞士乳杆菌发酵乳清制备抗氧化产物的发酵工艺为：培养温度37℃、培养时间18h、发酵初始pH6.0、接种量5%,所得水解产物的羟自由基清除率为54.73%,而未接种瑞士乳杆菌的发酵产物的羟自由基清除率为33.21%。证明了瑞士乳杆菌发酵乳清产物可以显著提高乳清的抗氧化活性。通过对瑞士乳杆菌发酵乳清所得抗氧化产物中游离巯基含量的测定,得到其中巯基含量较少,且产物的抗氧化活性与其中巯基含量不具有相关性,证明了在瑞士乳杆菌发酵乳清所得抗氧化产物中巯基对于抗氧化性的贡献很小。动物实验发现,未水解乳清、碱性蛋白酶酶解乳清产物和瑞士乳杆菌发酵乳清产物均可以显著提高衰老小鼠肝脏和血清中的超氧化物歧化酶（SOD）活性和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性,但不能可显著减少衰老小鼠肝脏和血清中的丙二醛（MDA）含量；且对于SOD活性和GSH-Px活力的提高,两种乳清水解产物的能力显著优于未水解乳清。上述动物实验结果表明碱性蛋白酶酶解乳清和瑞士乳杆菌发酵乳清均具有抗氧化活性,且抗氧化活性优于未水解乳清。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 乳清简介
• 1.1.1 乳清基本概念及分类
• 1.1.2 乳清蛋白和乳清蛋白源生物活性肽
• 1.1.3 乳清综合利用
• 1.2 肽的生产方法简介
• 1.2.1 水解法
• 1.2.1.1 化学水解法
• 1.2.1.2 酶解法
• 1.2.1.3 微生物发酵法
• 1.2.2 提取法
• 1.2.3 化学合成法
• 1.3 自由基和抗氧化活性物质的作用机理
• 1.3.1 自由基（FREE RADICALS）的定义
• 1.3.2 自由基的危害
• 1.3.3 抗氧化活性物质的作用机理
• 1.4 乳酸菌的抗氧化作用
• 1.4.1 国内外乳酸菌体外抗氧化的研究现状
• 1.4.2 国内外乳酸菌体内抗氧化的研究现状
• 1.5 瑞士乳杆菌简介
• 1.6 巯基（SULFHYDRYL）与抗氧化
• 1.7 抗氧化活性评价方法
• 1.7.1 体外检测
• 1.7.2 体内检测
• 1.8 TRICINE-SDS-PAGE电泳分离方法
• 1.9 本课题研究的目的、意义和内容
• 1.9.1 研究目的
• 1.9.2 研究意义
• 1.9.3 研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料、仪器与主要试剂
• 2.1.1 菌种、酶
• 2.1.2 主要原材料
• 2.1.3 实验动物
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 乳酸菌分离培养基
• 2.1.6 乳酸菌活化培养基
• 2.1.7 乳酸菌菌计数培养基
• 2.1.8 主要仪器
• 2.1.9 主要试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 酸乳清制备的工艺流程
• 2.2.2 酸乳清及其水解产物的成分测定
• 2.2.3 酸乳中乳酸菌的分离鉴定方法
• 2.2.4 菌种活化方法
• 2.2.5 高产蛋白酶活力乳酸菌菌株的筛选
• 2.2.6 碱性蛋白酶酶活力的测定
• 2.2.7 游离氨基酸含量的测定
• 2.2.8 酸度的测定
• 2.2.9 游离巯基含量的测定——Ellman法
• 2.2.10 产物抗氧化活性的测定
• 2.2.11 碱性蛋白酶水解乳清条件的优化
• 2.2.12 瑞士乳杆菌发酵酸乳清条件优化
• 2.2.13 电泳
• 2.2.14 水解产物抗氧化性的体内验证实验
• 3 结果与讨论
• 3.1 酸乳清的成分
• 3.2 酶解产物成分
• 3.3 发酵产物成分
• 3.4 碱性蛋白酶水解酸乳清条件的优化
• 3.4.1 酶解时间对产物抗氧化活性的影响
• 3.4.2 酶解温度对产物抗氧化活性的影响
• 3.4.3 酶解pH对产物抗氧化活性的影响
• 3.4.4 酶的添加量对产物抗氧化活性的影响
• 3.4.5 正交实验优化酶解条件
• 3.5 乳酸菌的分离鉴定
• 3.5.1 乳球菌鉴定
• 3.5.2 明串珠菌鉴定
• 3.5.3 链球菌鉴定
• 3.5.4 肠球菌鉴定
• 3.6 各菌种产蛋白酶活力测定
• 3.6.1 标准曲线
• 3.6.2 样品测定
• 3.7 瑞士乳杆菌发酵酸乳清条件优化
• 3.7.1 发酵时间对产物抗氧化活性的影响
• 3.7.2 发酵产物抗氧化活性与巯基含量的关系
• 3.7.3 发酵温度对产物抗氧化活性的影响
• 3.7.4 初始pH对产物抗氧化活性的影响
• 3.7.5 接种量对产物抗氧化活性的影响
• 3.7.6 Tricine-SDS-PAGE分离
• 3.7.7 正交实验
• 3.8 体内验证实验
• 3.8.1 实验前后小鼠体重变化
• 3.8.2 小鼠肝系数
• 3.8.3 小鼠血清与肝脏中超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定
• 3.8.4 小鼠血清与肝脏中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性的测定
• 3.8.5 小鼠血清与肝脏中丙二醛（MDA）含量的测定
• 4 结论
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 攻读硕士学位期间发表的论文
• 8 致谢