论文摘要
目的：1.研究DA（柔红霉素加阿糖胞苷）联合化疗加粒细胞集落刺激因子（G-CSF）方案（DAG）治疗难治、复发性PNH的疗效；2.观察PNH患者GPI-AP阳性和阴性的骨髓单个核细胞胞体外生长情况,比较两者对DAG方案体外反应的差异。同时比较G-CSF对GPI-AP阳性和阴性细胞表面G-CSF受体（CD114）表达的影响。为探索PNH细胞克隆对DAG反应异常的机制,进一步分析PNH患者和正常对照及PNH患者体内GPI-AP阳性和阴性细胞表面G-CSF受体（CD114）和黏附分子CD44/CD49d表达差异。3.通过体外研究PNH患者骨髓单个核细胞在不同条件孵育后CD71+CD59表达水平的变化,分析PNH患者是否适合输注“不洗涤”的红细胞,为PNH患者输血时选择“洗涤”或“不洗涤”红细胞提供理论依据。方法：第一部分：对10例难治、复发性PNH患者采用DAG方案：柔红霉素40mg第1、2天,20mg第3天,静滴,共3天；阿糖胞苷100mg/d,静滴,共5d-7d。化疗当天同时应用G-CSF300ug/d刺激造血直至患者度过骨髓抑制期,WBC恢复正常。观察患者血象、溶血指标及外周血CD59-中性粒细胞比例、糖皮质激素用量变化,观察并记录相关不良事件。第二部分：（1）无菌分离17例PNH患者BMMNCs,应用免疫磁珠技术将其分为CD59+细胞（GPI-AP阳性细胞）及CD59-细胞（GPI-AP阴性细胞）两部分,用液体IMDM培养基加多种造血刺激因子模拟骨髓微环境来体外培养,根据DAG体内浓度分别给予DAG方案和G-CSF干预48小时,观察这两部分细胞体外生长情况,应用流式细胞术检测两组细胞死亡、凋亡、细胞周期相关指标,比较两组细胞对DAG方案体外反应的差异。同时应用流式细胞术检测G-CSF干预48小时后GPI-AP阳性和阴性骨髓细胞表面G-CSF受体（CD114）表达水平的差异。（2）收集14例PNH患者外周血,应用流式细胞术检测GPI-AP阴性和阳性骨髓细胞表面黏附分子CD44/CD49d表达水平的差异,以探索PNH细胞克隆对DAG方案反应异常的机制。（3）收集22例PNH患者和14名正常对照BMMNCs,并将其中14例PNH患者骨髓标本应用免疫磁珠技术分为GPI阴性细胞、阳性细胞两部分,采用Q-PCR技术检测CD114和CD44/CD49d mRNA表达水平。第三部分：无菌分离17例PNH患者BMMNCs,分别与患者自身血清、自身冻融后血清、与患者血型相同非PNH对照病例血清（同型血清组）及与患者血型相同非PNH对照病例冻融上清（同型冻融血清组）共同孵育1h和3h,同时设置PBS组为对照组,流式细胞术检测CD71+CD59-细胞比例变化。收集10例以上不同条件孵育1h后的各组细胞,应用Q-PCR技术检测CD59mRNA的表达情况。所有的实验数据均应用SPSS软件和sigmaplot软件统计并作图。结果：第一部分：DAG方案治疗难治、复发性PNH的疗效观察。10例PNH患者化疗后均有效：（1）血红蛋白的改善：血红蛋白水平从（58.1±12.12）g/L升至（90.20±21.55）g/L（P<0.001）,10例患者中4例患者（不需要输血）血红蛋白水平明显提高,4例患者完全脱离输血,其中1个达到正常血红蛋白水平,1例病人输血间期延长：（2）溶血指标变化：关于IBIL和TBIL,除1例患者始终正常外,其他9例患者均下降：IBIL（36.8±29.2）U/L vs（18.1±12.4）U/L（P<0.05）,TBIL（48.8±36.15）U/L vs（27.2±15.8）U/L（P=0.065）；6例患者LDH降低（1656.12vs1269.33U/L；P=0.103）；10例患者网织红细胞降低（7.13±3.88）%vs（5.59±4.96）%（P=0.35）：4例患者游离血红蛋白浓度降低：72.50±61.31vs32.50±22.17（P=0.134）；1例患者Ham ’s test（+）vs Ham’s test（-）；（3）10例患者中,8例患者中粒细胞CD59-和CD55-的比例显著降低,化疗前后分别为（68.25±26.05）%和（81.47±26.13）%Vs（59.53±24.60）%和（68.14±26.53）%（P=0.007和P=0.003）；（4）糖皮质激素逐渐减量,且没有溶血发作,化疗前后分别为（45.84±19.05）mg vs（13.00±6.75）mg（P<0.001）；（5）安全性：血小板最低值为（1-60）×109/L,所有患者均未出现严重出血；白细胞和粒细胞的最低值分别为（0.2-4.68）×109/L和（0-1.8）×109/L。骨髓抑制期为10到23天,平均为19.76天。出现的不良事件包括：戊肝1例、无效输注1例、高热无明确感染灶2例、上呼吸道感染3例、肺炎1例、败血症1例、口腔溃疡]例,经过积极有效的抗感染及成分血输注,均得以控制。第二部分：（1）间接免疫磁珠技术能将PNH患者骨髓中GPI-AP阴性细胞分离纯化,其纯度可高达90%以上。PNH患者骨髓GPI-AP阴性和阳性细胞在体外培养中对DAG反应的差别：DAG方案体外干预GPI-AP阴性和阳性细胞48小时后,其死亡率和凋亡率变化：GPI-AP阴性细胞未加DAG干预组（对照组）死亡率和凋亡率分别为19.10±20.93%和7.2±6.76%,DAG方案干预组死亡率为和凋亡率分别为27.29±22.04%和10.55±12.34%；而GPI-AP阳性细胞未加DAG干预组（对照组）死亡率和凋亡率分别为12.83±18.92%和凋亡率为9.66±7.96%,加DAG方案干预组死亡率和凋亡率分别为31.89±26.75%和凋亡率为6.31±1.32%；且与对照组相比,DAG方案干预组GPI-AP阳性死亡率显著增高（P<0.05）,而GPI-AP阴性细胞死亡率亦增加,但无统计学意义,且GPI-AP阴性和阳性细胞凋亡率无显著增加；DAG方案干预组GPI-AP阴性和阳性细胞死亡率均显著大于凋亡率（P<0.05）。细胞周期的变化：与对照组相比较,DAG方案干预组GPI-AP阴性细胞和阳性细胞的细胞周期G0/G1及S期比例均无显著性差异,DAG方案对两者的细胞周期无明显影响。G-CSF受体（CD114）的变化：与对照组相比较,G-CSF方案干预组GPI-AP阴性和阳性细胞的CD114表达均增加,分别为41.76±44.62%vs26.79±41.62%和48.12±41.20%vs12.84±15.32%（P<0.05）,前者不具有统计学差异。而GPI-AP阴性细胞和GPI-AP阳性相比较,GPI-AP阳性CD114表达的增加量更加显著（33.97±36.03%Vs14.88±27.02%）（P<0.05）。（2）CD44/CD49d蛋白的表达：GPI-AP阴性和阳性细胞CD44的表达率分别为93.46±9.52%和97.66±4.21%,GPI-AP阳性细胞CD44表达更高,差别具有统计学意义（P<0.05）；GPI-AP阴性和阳性细胞CD49d的表达率分别为38.46±27.37%和43.79±24.77%,后者大于前者,但是尚不具有统计学差异。（3）Q-PCR检测了22例PNH患者（对照组15例）及14例GPI-AP阴性和阳性细胞CD114mRNA的表达情况：与正常对照组相比较,PNH病例组为1.75±1.90,对照组为2.57±2.18,两者无统计学差异；而GPI-AP阴性和阳性细胞分别为1.69±2.34和2.78±2.52,差异具有统计学意义（P<0.05）。CD44mRNA的表达情况：PNH组与正常对照组相比较,CD44mRNA分别为1.73±2.20和3.80±3.87,差异具有统计学意义（P<0.05）；同时14例GPI-AP阴性和阳性细胞的相比较,CD44mRNA分别为0.82±0.75和2.38±2.42（P<0.05）；CD49d mRNA的表达情况：正常对照组和PNH病例组相比较,分别为2.83±2.62和2.56±3.04,差异无统计学意义；而14例GPI-AP阴性和阳性细胞的相比较,CD49d mRNA分别为1.74±2.60和1.94±3.02,两者无统计学差异。第三部分：17例PNH患者BMMNCs,在不同条件下孵育后,CD71+CD59-细胞比例变化：①1h后：对照组、自身血清、自身冻融血清组、同型血清组及同型冻融血清组分别为75.08±27.27%,72.80±26.97%,68.75±25.71%,68.35±29.19%,60.45±31.37%,与对照组相比较,自身冻融血清组及同型冻融血清组CD71+CD59-细胞比例均显著降低（P<0.05；P<0.01）；②3h后：各个组对应的CD71+CD59-细胞比例分别为73.84±27.63%、74.07±29.47%、65.51±29.15%、64.91±33.50%、60.05±27.79%,与对照组相比,自身冻融血清组及同型冻融血清组CD71+CD59-细胞比例有下降趋势,但无统计学意义。同时收集10例不同条件孵育1h后各组细胞,Q-PCR检测CD59mRNA的表达情况,结果为对照组、自身血清、自身冻融血清、同型血清组及同型冻融血清组CD59mRNA的表达情况为分别为1.72±2.27、2.88±5.60、2.53±3.45、1.48±1.79和1.44±2.31,各组之间均无统计学差异。结论：1、DA联合化疗加G-CSF方案（DAG）可以减少PNH克隆,使正常造血克隆有机会扩增,从而促进正常造血,同时还能控制溶血发作,减少皮质激素用量,且无严重不良事件发生,是目前较有希望和广泛应用前景的治疗手段。2、DAG对PNH患者骨髓中GPI阴性克隆、阳性克隆的影响相似,而且均以导致两者死亡的方式发挥作用,且对其细胞周期无显著影响。3、在体外,G-CSF能分别刺激骨髓中GPI阴性克隆、阳性克隆的CD114的表达,而且对GPI阳性克隆的刺激作用更明显。此外,与GPI阳性相比,GPI阴性细胞CD114mRNA水平均显著降低。这可能是G-CSF发挥作用的分子机制之一。4、通过PNH患者与正常对照及GPI阴性克隆与GPI阳性克隆相比较,CD44蛋白水平及mRNA水平较低,差别具有显著性。而CD49d的表达在GPI阴性克隆中较低,但无显著性差异。粘附分子CD44的表达降低导致这部分细胞不能充分的利用骨髓微环境的“造血龛”而呈造血相对弱势,这可能是体内外GPI阴性克隆造血功能差的另一机制。5、与血型相同的外周血溶血上清孵育后,PNH患者的CD71+CD59-比例显著降低,但CD59的mRNA水平无显著变化,说明输注“不洗涤”的红细胞可降低PNH患者的PNH克隆的比例,从而减轻溶血,这为PNH患者输注“不洗涤”的红细胞提供了理论依据。
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