论文摘要
目的1.分别研究p27kip1 2个主要磷酸化位点—187位苏氨酸（Thr）和10位丝氨酸（Ser）,在非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin’s lymphoma,NHL）病例中的异常磷酸化情况,结合增殖指标Ki-67、p27kip1相关蛋白Skp2、Jab1及临床相关资料,初步探讨p27kip1异常磷酸化与NHL发生、发展的关系。2.在细胞水平,分别探讨p27kip1Thr187、Ser10磷酸化异常与淋巴瘤细胞生长周期的关系。方法1.首先在组织水平,选取116例NHL,其中惰性NHL18例,包括11例滤泡性淋巴瘤（Follicular center cell lymphoma）和7例胃肠黏膜相关淋巴组织淋巴瘤（Marginal zone B-cell lymphoma of MALT type）;侵袭性NHL98例,包括37例弥漫性大B细胞淋巴瘤（Diffuse large B-cell lymphoma）,49例鼻NK/T细胞淋巴瘤（NK/T lymphoma）,12例外周非特殊型T细胞淋巴瘤（Unspecified peripheral T-cell lymphoma）。另取同时期保存的15例良性增生淋巴结作为对照。采用免疫组化方法,检测Thr187磷酸化p27kip1、Ser10磷酸化p27kip1及p27kip1相关分子Jab1表达情况,SPSS13.0统计软件分析数据。2.采用RT-PCR技术扩增人类Jab1全长序列,通过DNA重组技术分别将其重组于pcDNA3.1-Myc及pcDNA3.1载体,构建Jab1正义表达质粒,酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组表达质粒进行鉴定。3.采用血清饥饿合并释放同步化处理淋巴瘤细胞,流式细胞仪检测细胞周期,Western blot、免疫荧光、免疫沉淀及核浆分离技术检测Thr187磷酸化p27kip1、Ser10磷酸化p27kip1及p27kip1相关分子Skp2、Jab1等在细胞内的表达、亚细胞定位。应用pcDNA3.1-Myc-Jab1表达质粒采用脂质体瞬时转染淋巴瘤细胞,流式细胞仪分析增加Jab1表达对淋巴瘤细胞周期的影响,Western blot、免疫荧光、核浆分离及免疫沉淀检测Jab1过表达对p27kip1的表达、亚细胞定位及功能的影响。结果1.免疫组化结果显示:1) NHL中Thr187磷酸化p27kip1阳性率明显高于良性增生性淋巴结中（生发中心以外）的表达水平。结合临床资料分析显示:Thr187磷酸化p27kip1与NHL病人的年龄、临床分期有相关性。病人年龄越大,临床分期越晚,其阳性率越高;与NHL病人性别、淋巴结转移情况无明显相关性。相关分析显示:Thr187磷酸化p27kip1与Ki-67表达呈正相关（rs = 0.639,P<0.001）;Thr187磷酸化p27kip1与Skp2表达呈正相关（rs= 0.594,P<0.001）;Thr187磷酸化p27kip1与p27kip1的表达呈正相关（rs = 0.175,P<0.001）。生存分析显示:Thr187p27kip1磷酸化阳性（>10%）的病人,其五年生存率明显低于阴性（≤10%）的病人（P < 0.001）。2) Ser10磷酸化p27kip1、Jab1蛋白阳性率均明显高于良性增生性淋巴结中（生发中心以外）的表达水平。结合临床资料分析显示:Ser10磷酸化p27kip1、Jab1蛋白表达与NHL临床分期有相关性。与NHL病人年龄、性别、淋巴结转移情况无明显相关性。相关分析显示:Ser10磷酸化p27kip1与Ki-67表达无明显相关性;Ser10磷酸化p27kip1与Jab1表达呈正相关（rs= 0.696,P<0.001）;Ser10磷酸化p27kip1与p27kip1的表达呈负相关（rs = -0.457,P<0.001）;Jab1蛋白与增殖指标Ki-67表达呈正相关（rs = 0.870,P<0.001）;Jab1蛋白与p27kip1蛋白表达呈明显负相关（rs = -0.380,P<0.001）。生存分析显示:Ser10磷酸化p27kip1阳性（>10%）、Jab1阳性（>10%）的病人,其五年生存率均明显低于阴性（≤10%）的病人（P < 0.001）。2.构建pcDNA3.1-Myc-Jab1正义表达质粒,通过酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组表达质粒进行鉴定,证实构建成功。3.血清饥饿合并释放能够刺激淋巴瘤细胞同步化生长,随着细胞周期进程:1)Thr187磷酸化p27kip1表达增加,并且主要位于胞核内;p27kip1对cyclinE/CDK2复合物抑制作用减弱,CDK2激酶活性增强。2)Ser10磷酸化p27kip1与Jab1表达明显增加;Jab1过表达导致p27kip1磷酸化形式改变,胞浆分布增多,与CDK分子的亲和能力改变,最终促进细胞进入S期。结论1. p27kip1Thr187、Ser10两个位点的磷酸化异常与NHL病例恶性程度密切相关。提示:p27kip1Thr187、Ser10两个磷酸化位点可能分别通过不同途径使p27kip1表达及功能发生异常,导致细胞周期失控并促进细胞异常增殖,从而参与了NHL的发生和发展。2.成功构建了人类Jab1正义表达质粒,为进一步探讨Jab1基因在NHL发生发展中的作用奠定了实验基础。3.在细胞水平,Thr187磷酸化p27kip1可能通过泛素-蛋白酶体途径影响p27kip1的降解,而Ser10磷酸化p27kip1与Jab1从介导p27kip1出核这一途径影响p27kip1的核内外分布,两个磷酸化位点通过各自的功能特点调节p27kip1的表达及功能,从而参与对淋巴瘤细胞生长的调控。