表达两种不同血清型的鸭大肠杆菌融合株的构建及其免疫原性的研究

论文摘要

随着我国养禽业的快速发展,禽大肠杆菌病的流行日益严重,给养禽业造成了很大的经济损失,也对消费者的健康构成较大的威胁,因此有效防治禽大肠杆菌病具有重要的公共卫生学意义。免疫预防在防治大肠杆菌病中具有重要意义,然而大肠杆菌血清型众多,而且不同地区有不同的优势血清群。所以制备多价苗具有扩大应用范围的意义,然而多价苗具有单位效价低的缺点,制备融合菌苗将能改善这一问题。本文通过构建可同时表达两种不同血清型的鸭源大肠杆菌融合菌株,并对该融合菌株进行生理生化特性,血清型鉴定,免疫学研究,选择适合的融合菌株制备双价苗。亲本菌株的筛选采用血清型鉴定结合药敏纸片法：筛选血清型不同,而抗药性互补的两株鸭大肠杆菌。血清型鉴定结果显示供试的大肠杆菌血清型种类多,其中优势血清型为O78和O2；药敏试验结果显示四川省部分地区鸭大肠杆菌耐药情况已十分严重,其中耐药率高于90%的有青霉素G、链霉素、四环素、强力霉素、红霉素、麦迪霉素和复方新诺明共7种抗菌药,多重耐药情况也较严重；通过血清鉴定试验和药敏试验,筛选出了本研究的试验菌株为种鸭大肠杆菌ZYD5和ZYD8,再通过MIC测定,得到了ZYD5和ZYD8融合子的初筛标记为40μg/mL庆大霉素和30μg/mL盐酸环丙沙星。融合菌株的构建采用细菌原生质体融合技术—溶菌酶去除细胞壁制备原生质体,PEG促融制备融合子,高渗选择性培养基再生融合子。融合子的筛选主要从血清表型、生理生化特性、生长特性、染色特性和遗传稳定性等方面进行考察。本研究通过预实验确定了原生质体制备的工作酶浓度为0.25 mg/ml,作用时间为15 min,融合子的阳性重组率为1.63%,最终获得了3株可同时表达两亲本血清型的融合子。试验表明融合菌株的染色形态呈现为典型的大肠杆菌形态,生化特性符合大肠杆菌的生化特性,耐药性间于两亲本之间,生长量略低于亲本株生长量,具有遗传稳定性。用亲本菌株和融合株分别接种试验动物比较各菌株毒力大小,再制备蜂胶灭活苗,免疫雏鸭,比较各疫苗的免疫保护率和抗体水平,评价融合菌苗的免疫效果。通过试验测得ZYD5、ZYD8、R-ZYD109、R-ZYD113和R-ZYD267的LD50分别是1.0×106CFU/0.5mL、2.5×107 CFU/0.5mL、3.1×108 CFU/0.5mL、2.7×108 CFU/0.5mL和3.5×108CFU/0.5mL。融合株毒力测定结果显示融合菌株的毒力有所降低,除可用以制备灭活苗,还可以尝试研制弱毒苗。首免后ZYD二价苗、R-ZYD109苗、R-ZYD113苗和R-ZYD267苗试验组对ZYD5的攻毒保护率为50%～60%,二免后的攻毒保护率为60%～80%；上述四种苗首免后对ZYD8的攻毒保护率为40%～50%,二免后的攻毒保护率为60%～80%,说明各菌苗均有一定的免疫保护效果,而且两次免疫比一次免疫具有更高的保护率。在给雏鸭分别注射ZYD二价苗和含有O2和078两种血清型的融合株蜂胶灭活疫苗后第7d开始,针对ZYD8和ZYD5的抗体水平开始逐渐上升,14d时2次免疫组的抗体水平高于1次免疫组,1次免疫组和2次免疫组的抗体水平均于免疫后28 d左右达到最高水平,然后1次免疫组和2次免疫组的抗体水平均开始缓慢下降,到第56 d时1次免疫组和2次免疫组的抗体水平均高于同组免疫后第14d的抗体水平。抗体水平检测结果显示融合株菌苗和亲本二价苗二免雏鸭的抗体水平差异不显著（P>0.05）,证明融合菌苗可以替代亲本二价苗免疫保护雏鸭。可同时表达两种不同血清型的鸭源大肠杆菌融合菌株的成功构建,有利于提高疫苗中单因子的单位抗原含量,简化了菌苗的生产过程,同时节省培养时间及原料,提高免疫效果和经济效益。本研究为研制含有多价保护性抗原的禽大肠杆菌病新型疫苗提供了一定的实验基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 文献综述
• 1.1 鸭大肠杆菌病研究概述
• 1.1.1 大肠杆菌表面抗原类型
• 1.1.2 防治研究
• 1.2 原生质体融合育种研究概况
• 1.2.1 原生质体融合技术的优缺点
• 1.2.2 原生质体制备及其影响因素
• 1.2.3 原生质体再生及其影响因素
• 1.2.4 原生质体融合方法及影响因素
• 1.2.5 融合子检出筛选方法
• 1.2.6 原生质体技术在大肠杆菌上的应用前景与展望
• 1.3 本研究的目的意义
• 2 鸭大肠杆菌融合亲本菌的筛选
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 主要培养基及溶液
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 血清型鉴定
• 2.2.2 药敏试验
• 2.2.3 最低体外抑菌浓度（MIC）的测定
• 2.3 结果
• 2.3.1 血清型鉴定结果
• 2.3.2 药敏试验结果
• 2.3.3 MIC的测定结果
• 2.4 讨论
• 3 鸭大肠杆菌ZYD5与ZYD8融合株的构建与筛选
• 3.1 材料
• 3.1.1 亲本菌株
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 培养基
• 3.1.4 主要溶液
• 3.1.5 主要仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 两亲本菌株生长曲线的测定
• 3.2.2 亲本株的培养
• 3.2.3 原生质体的制备、融合及再生
• 3.2.4 融合菌株的检出、稳定性试验及鉴定
• 3.3 结果
• 3.3.1 亲本菌株原生质体制备菌龄的选择
• 3.3.2 融合体再生、检出
• 3.3.3 融合株血清型鉴定结果
• 3.3.4 生化鉴定结果
• 3.3.5 药敏试验结果
• 3.3.6 融合株生长曲线
• 3.3.7 融合株稳定性试验结果
• 3.4 讨论
• 4 融合株毒力测定及免疫保护率测定
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌株
• 4.1.2 实验动物
• 4.1.3 培养基
• 4.1.4 试验仪器
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 菌液制备和检验
• 4.2.2 菌液毒力测定
• 4.2.3 亲本株二价苗、融合株菌苗制备
• 4.2.4 疫苗免疫与攻毒保护试验
• 4.2.5 微量凝集试验
• 4.3 结果
• 4.3.1 菌液毒力测定结果
• 4.3.2 疫苗的攻毒保护试验
• 4.3.3 微量凝集试验结果
• 4.4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢