论文摘要
目的：关节软骨损伤已经成为骨科临床的常见疾病。软骨损伤的修复一直是关节外科领域的难点及研究热点。本课题采用以“少阳主骨”为理论基础拟定的少阳生骨方干预体外关节软骨细胞培养和关节软骨损伤的动物模型,通过CCK-8法检测细胞增值、免疫组化法检测Ⅱ型胶原、RT-PCR法检测Ⅱ型胶原mRNA表达、放射免疫分析法（RIA）测定细胞因子IL-1β的变化,以及对软骨损伤后关节软骨组织形态和超微结构的改变,在细胞和分子水平的层面,探讨“少阳生骨方”治疗软骨损伤的可行性及可能机制,为应用中医药理论治疗软骨损伤提供有力的实验依据和开辟新的途径。为下一步继续研究少阳生骨方修复软骨损伤的机理和从分子生物学及细胞学水平进一步阐明该方的作用奠定基础。方法本实验分为四个部分第一部分：少阳生骨方含药血清对体外培养SD大鼠关节软骨细胞的影响获取1周龄SD大鼠关节软骨细胞进行单层细胞培养,取第三代传代软骨细胞,按1*105/ml的密度接种培养瓶中,分少阳生骨方（实验组）、盐酸氨基葡萄糖胶囊（对照组）及生理盐水（空白组）三组干预并获得含药血清,每组按0.6%、1.2%、2.4%的血清浓度加入培养基中干预72小时。干预72小时候后采用CCK-8法检测细胞增值、免疫组化法检测Ⅱ型胶原、RT-PCR法检测Ⅱ型胶原mRNA表达及细胞形态变化。第二部分：少阳生骨方含药血清对体外SD大鼠去分化关节软骨细胞的影响获取1周龄SD大鼠关节软骨细胞进行单层细胞培养,取第五代传代软骨细胞,按1*105/ml的密度接种培养瓶中,分少阳生骨方（实验组）、盐酸氨基葡萄糖胶囊（对照组）及生理盐水（空白组）三组干预并获得含药血清,每组按0.6%、1.2%、2.4%的血清浓度加入培养基中干预72小时,干预72小时候后采用CCK-8法检测细胞增值、免疫组化法检测Ⅱ型胶原、RT-PCR法检测Ⅱ型胶原mRNA表达及细胞形态变化。第三部分：少阳生骨方对SD大鼠在体软骨损伤后软骨组织形态和基质胶原表型表达的影响选用在相同条件下喂养的6～8周清洁级SD大鼠（泸州医学院动物实验中心提供）27只,雌雄不限,体重200±20g。按照组内均衡一致原则随机编为3组,即少阳生骨方组实验组（S组）、盐酸氨基葡萄糖胶囊组对照组（A组）和空白对照组（K组）,每组9只。无菌条件下在股骨滑车正中用一直径为2.5mm克氏针钻孔,形成全厚软骨缺损,成为关节软骨损伤动物模型,于造模完成后的第二天,开始灌胃药物,S组少阳生骨方灌胃,A组盐酸氨基葡萄糖胶囊灌胃,K组生理盐水灌胃。连续灌胃4周,分别于灌胃后4、8、12周每组随机处死3只大鼠获取双侧软骨标本,肉眼观察关节软骨损伤处修复软骨情况,标本HE、甲苯胺蓝、Masson染色,光镜观察,按Mankin评分标准由进行评分,免疫组化染色检测Ⅰ、Ⅱ型胶原表达。第四部分：少阳生骨方对在体软骨损伤后关节液IL-1β水平的影响参照实验三步骤分别于术后4周、8周、12周三个点处死动物前,于双膝关节分别用1ml无菌生理盐水冲洗,获取关节液,采用放射免疫分析法（RIA）测定IL-1B水平,并绘制标准曲线。结果1.采用联合酶消化方法建立大鼠软骨细胞体外培养体系,经倒置显微镜下形态学观察及甲苯胺蓝染色鉴定,确认分离培养的细胞符合软骨细胞的生物学特征、形态学、组织化学染色显示软骨细胞培养传3代以内可以保持表型的稳定。对软骨细胞增殖的观察显示：少阳生骨方（SYSGF）0.6%、1.2%、2.4%含药浓度的血清均能促进体外正常软骨细胞增殖,但增殖的效应不随浓度的递增而增加,以1.2%的含药血清浓度促进正常培养关节软骨细胞增殖最为明显,且在48时促进增殖作用最佳。其增殖作用强于空白组,但不及2.4%的氨基葡萄糖胶囊组；免疫组织化学结果显示：三组标本的胞浆可见片状或团块状棕红色颗粒染色,此为Ⅱ型胶原表达。1.2%空白血清诱导的软骨细胞表达Ⅱ型胶原蛋白最弱。1.2%SYSGF组表达Ⅱ型胶原蛋白比1.2%空白血清组数目多,且可见细胞分裂相,呈显著差异（P<0.05）; RT-PCR法不同浓度目的基因与内参基因光密度比值统计结果。显示实验组Ⅱ型胶原基因的表达与空白组相比,均有表达的增加。但是少阳生骨方组和盐酸氨基葡萄糖组相比其结果没有统计学差异。以上结果说明中药少阳生骨方能在一定程度上促进软骨细胞增殖,促进软细胞合成分泌Ⅱ型胶原蛋白。2.不同浓度的药物血清对第五代软骨细胞干预72小时后倒置显微镜观察：实验组细胞形态呈梭形、三角形、多形性,细胞胞浆较多,生长状态很好,细胞活性较好。CCK-8法测定用药48小时后少阳生骨方组与与空白组相比,有统计学差异（P<0.05）。而第一天和第三天数据有差异,但没有统计学意义。免疫组化法测定72小时候后Ⅱ型胶原染色表达阳性率检测结果,三组实验组与空白组相比,其Ⅱ型胶原表达阳性率均好于空白对照组。但是少阳生骨方组和盐酸氨基葡萄糖组差异不大,其差异性没有统计学意义。RT-PCR法半定量观察去分化软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA表达显示,实验组Ⅱ型胶原基因的表达与空白组相比,均有表达的增加。但是少阳生骨方组和盐酸氨基葡萄糖组相比其结果没有统计学差异。3.少阳生骨方对SD大鼠在体软骨损伤后软骨组织形态和基质胶原表型表达的影响结果显示：大体观察和组织学观察均显示S、A组软骨缺损修复组织的数量及质量均优于K组,且S组的修复效果强于A组。对比空白组,少阳生骨方和盐酸氨基葡萄糖胶囊均可提高软骨损伤后修复组织中Ⅱ型胶原的表达（P<0.05）,但两组比较无统计学意义（P>0.05）。4.少阳生骨方对在体软骨损伤后关节液IL-1β水平的影响结果显示：三组关节液中IL-1β水平检测,S组和A比较：第4、8、12周A组高于S组（P<0.05）；第4、8、12周K组高于S组（P<0.05）；第4、8、12周K组高于A组（P<0.05）。治疗前后自身比较：S组第8周、第12周与第4周相比无明显差异（P>0.05）；A组第8周、第12周均低于第4周（P<0.05）；K组第4周>第8周>第12周（P<0.05）。结论1.不同浓度少阳生骨方含药血清,均能促进SD大鼠体外第三代软骨细胞的增殖及Ⅱ型胶原表达,但并不随含药血清浓度的增加而增加,1.2%浓度促进其增殖表达能力最强,过高的浓度可能抑制其增殖、表达。2.不同浓度少阳生骨方含药血清,均能提高SD大鼠体外第五代软骨细胞Ⅱ型胶原及蛋白多糖表达及合成,维持软骨细胞表型稳定,但作用有限。3.少阳生骨方能促进SD大鼠在体软骨损伤后软骨的修复,且修复组织更接近透明软骨。4.少阳生骨方能明显降低SD大鼠在体软骨损伤后关节液的IL-1β水平,从而促进软骨细胞的修复。