甲型H1N1流感病毒血凝素基因的表达和免疫原性分析

论文摘要

流感病毒（influenza virus）是引起人类呼吸道感染及引起人类死亡的主要病因之一。人类曾多次遭受过流感病毒大流行（1918年H1N1亚型,1957年H2N2亚型,1968年H3N2亚型,1977年H1N1亚型）。至今人类仍然无法征服流感病毒。快速检测及接种疫苗被认为是控制并清除流感病毒经济有效的手段。实时荧光定量PCR检测流感病毒具有快速、特异性高的特点,但花费昂贵,不适合大面积推广；当前使用的疫苗有流感减毒疫苗、灭活疫苗、裂解疫苗等,这些疫苗能够在人体中产生保护性抗体,但是都有一定的缺陷,如减毒疫苗具有毒力回复的潜在性危险,而后两种却很难产生细胞免疫应答。因此,迫切需要研制一种快速的检测流感病毒的方法及新型有效的疫苗。当前发表的许多文章都证实了流感病毒糖蛋白抗原的保护性作用,在这些糖蛋白抗原中,血凝素（HA）的作用相当重要。HA具有免疫原性,抗血凝素抗体可以中和流感病毒,是主要的保护性抗原。因此,针对HA蛋白的重要性,以GenBank公布的A/California/05/2009H1N1流感病毒HA基因为目的基因,从GenBank数据库中下载HA基因序列,进行全基因合成,将人工合成的甲型H1N1流感病毒的HA基因克隆到原核表达载体pET30a+上,构建重组表达质粒,并转化Ecoli BL21（DE3）,以IPTG对重组菌BL21（DE3）（pET-HA）进行诱导表达,表达产物His-HA融合蛋白通过变复性后纯化。Western blot试验结果表明表达产物His-HA融合蛋白能特异性地与人甲型H1N1流感患者阳性血清反应,证明表达产物His-HA融合蛋白具有免疫反应活性。利用该His-HA融合蛋白的建立检测抗体的ELISA方法,并探究ELISA方法的最适宜条件,ELISA方法的适宜条件为原核表达产物His-HA融合蛋白以1μg/孔包板,检测血清的稀释度为1：80到1：640间；以建立的ELISA检测300份人源血清样品,阳性血清数量为74份,阳性率为24.67%,并与商品化试剂盒进行对比,符合率为98.65%,对比试验说明建立的ELISA方法具有可行性。将人工合成的甲型H1N1流感病毒的HA基因克隆到pFastBacl转移载体,转化DH5a,然后在含Kan抗生素的LB平板上挑取阳性菌落,得到的重组转移质粒pFastBac-HA,再提取阳性克隆质粒转化到含杆状病毒穿梭载体Bacmid的受体菌E. coli DH10Bac中,发生转座作用,在含庆大霉素、卡那霉素、四环素3种抗生素和X-gal/IPTG的LB培养板上,筛选出白色菌落得到重组穿梭载体Bacmid-HA.经PCR鉴定为阳性后,采用阳离子脂质体法转染到Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒,通过IFA、SDS-PAGE及Western blot试验证实在Sf9细胞中HA蛋白得到表达。血凝试验结果表明表达产物HA蛋白血凝价为1：16,血凝试验证实真核表达产物具有生物活性。将真核表达的HA蛋白以100μg/只的剂量,通过皮下注射BALB/c小鼠,探讨其免疫原性,ELISA检测免疫小鼠血清的抗体效价,结果显示,二免14天,HA蛋白免疫组的抗体效价与空白对照组之间呈现显著差异（p<0.05）。HA蛋白免疫小鼠血清血凝抑制试验血凝抑制价为1:16。ELISPOT检测免疫小鼠分泌细胞因子IL-4和IFN-γ脾脏淋巴细胞,结果显示产生IFN-γ的分泌细胞少于产生IL-4的分泌细胞,Prism软件包分析表明,两者存在显著差异（p<0.05）,免疫小鼠体内趋向于Th-2为主的免疫应答。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 符号说明
• 文献综述
• 1 流感病毒概况
• 2 甲型（H1N1）流感病毒概况
• 3 流感疫苗的研究
• 参考文献
• 第一章 甲型流感病毒HIN1亚型HA基因的原核表达及免疫反应性分析和ELISA方法的建立
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第二章 甲型流感病毒H1N1亚型HA基因在杆状病毒系统中的表达及免疫原性分析
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表论文目录