小麦蛋白质二硫键异构酶基因的原核表达及DsbA辅助LMW-GS的功能鉴定研究

论文摘要

蛋白质二硫键异构酶（Protein disulfide isomerase,PDI;EC 5.3.4.1）在不同物种中广泛存在,在大部分组织和器官中为组成型表达,并通过内质网驻留信号肽驻留在内质网中,含量达到毫摩尔级,是内质网中含量最丰富的蛋白之一。存在于大肠杆菌周质腔中的二硫键异构酶DsbA能够加快分泌蛋白质中二硫键的催化形成,是Dsb家族中氧化能力最强的蛋白。小麦面筋的强度主要是由麦谷蛋白亚基之间通过二硫键形成的谷蛋白聚合体控制的,低分子量谷蛋白亚基（LMW-GS）是麦谷蛋白聚合体中的重要组成部分,能赋予面团良好的延展性,其变异与面包小麦以及硬粒小麦的面团品质显著相关。本研究通过RT-PCR从小麦品种“陕253”中获得PDI的一条cDNA序列,成功构建了小麦PDI基因的融合表达载体,进行原核表达。表达蛋白经亲和层析、纯化后,用SDS-PAGE检测蛋白纯度。同时采用通用引物从优质强筋小麦品种“陕253”和大肠杆菌基因组DNA中克隆目的基因,利用重叠延伸PCR法构建了LMW/DsbA双顺反子表达载体,采用E. coLi原核表达系统表达低分子量谷蛋白。通过氧化-还原反应将纯化亚基整合到基础面粉中,采用10 g粉质仪进行掺粉实验,研究低分子量谷蛋白对面团流变学特性的影响,结果如下:1.获得1条小麦PDI的cDNA序列（GenBank登录号为HQ911363）,在NCBI数据库进行BLAST比对分析,结果表明与已经公布的小麦PDI基因序列相似性可达99.81%。氨基酸序列分析表明,HQ911363编码的蛋白在65-72位和409-416处含有的两个异构酶活性的氧化还原活性位点,包含保守结构域-CGHC-,是PDI执行生物学功能必须的。C端末尾含有典型的内质网驻留信号肽元件-KDEL-。序列比对分析得出在氧化还原活性位点和内质网驻留信号肽区氨基酸序列都高度保守。2.将HQ911363编码的蛋白与NCBI基因库中收录的普通小麦（BAH20801和CAI30632）,圆锥小麦（CAC21228）、大麦（AAA70345）、玉米（AAX09971）、埃塞俄比亚芥（ABB17025）、苜蓿（ACJ85784）和烟草（CAA72092）利用MEGA 4.0构建的系统进化树说明HQ911363与普通小麦和圆锥小麦的PDI亲缘关系最近,与烟草的最远。3.表达引物F2和R2扩增经测序验证正确的重组克隆质粒,BamH I和Hind III双酶切PCR产物和原核表达质粒pET-32a（+）,酶切后的目的片段用T4 DNA连接酶连接。将构建的重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株。菌落PCR和双酶切检测均出现一条1500 bp左右的片段,与目的片段大小相符。重组表达质粒经再次测序验证, PDI基因的原核表达载体构建成功。4.在37°C经过1 mM IPTG诱导8小时后,采用12% SDS-PAGE和Western blot分析,结果表明在72 kDa处均出现目的条带,结果与预测的融合蛋白分子量相符。经?KTA purifier 100蛋白层析系统（Amersham Biosciences,NJ）纯化获得纯化的目的蛋白,纯化产物经SDS-PAGE检测证实已得到单一的目的蛋白。5.获得了3条小麦低分子量谷蛋白基因（GenBank登录号为JF439428,JF439429,JF439430）,片段长度均为903bp。序列分析显示,三个基因编码的蛋白属于LMW-m型的低分子量谷蛋白。序列比对显示,JF439428,JF439429和JF439430推导的氨基酸序列间仅存在3个位点的变异:其中重复区有两个,分别出现在第53位（F→L）和第108位（Q→R）;另一个出现在229位的C-terminal II区（S→F）。进化树分析这三个基因编码蛋白属于Glu-B3位点编码的m型的低分子量谷蛋白。6.由于序列间的差异很小,选择JF439428构建LMW/DsbA双顺反子表达载体。设计一对表达引物,扩增不含信号肽片段。在宿主菌E. coli BL21（DE3）中经IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot检测,在52 kDa处出现了目的蛋白条带,证实外源蛋白表达成功。可溶性对比分析表明,表达蛋白一部分以可溶形式存在于共表达DsbA的细菌裂解液的上清中,共表达的DsbA能促进LMW-GS在大肠杆菌中的可溶性表达。7.掺粉实验说明,在加入外源蛋白后,6个主要的粉质参数都发生了变化,而且升降趋势不一。弱化度和机械耐力系数有所降低,面团的形成时间、稳定时间、断裂时间、粉质质量指数等主要的粉质参数均有所增加,该亚基对面团流变学性质整体表现有利。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 蛋白质二硫键异构酶
• 1.1.1 蛋白质二硫键
• 1.1.2 PDI 家族的成员
• 1.1.3 PDI
• 1.1.4 DsbA
• 1.1.5 PDI 家族的其它成员
• 1.1.6 PDI 家族的结构特征
• 1.2 小麦低分子量麦谷蛋白研究进展
• 1.2.1 低分子量麦谷蛋白的分类
• 1.2.2 低分子量谷蛋白亚基分子的Cys 的分布及其结构
• 1.2.3 低分子量麦谷蛋白的染色体定位
• 1.2.4 谷蛋白聚合体的构成
• 1.2.5 低分子量谷蛋白对加工品质的影响
• 1.2.6 低分子量谷蛋白亚基体外功能鉴定研究
• 1.3 本研究的目的和意义
• 第二章 小麦“陕253”PDI 基因原核表达及蛋白纯化
• 2.1 材料
• 2.1.1 供试材料
• 2.1.2 溶液的配制
• 2.1.3 仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 引物设计
• 2.2.2 小麦总RNA 的提取
• 2.2.3 目的基因的扩增
• 2.2.4 目的片段的回收纯化
• 2.2.5 目的片段的克隆
• 2.2.6 表达载体的构建
• 2.2.7 重组质粒的诱导表达
• 2.2.8 重组蛋白的Western blot 分析
• 2.2.9 重组蛋白的纯化
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 PDI 基因的克隆
• 2.3.2 目的片段的序列分析
• 2.3.3 表达载体的构建和重组质粒的鉴定
• 2.3.4 融合基因的诱导表达和纯化
• 2.4 讨论
• 第三章 LMW/DsbA 双顺反子表达载体构建、原核表达及亚基品质效应鉴定
• 3.1 材料
• 3.1.1 供试材料
• 3.1.2 溶液的配制
• 3.1.3 仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 引物设计
• 3.2.2 基因组DNA 的提取
• 3.2.3 目的基因的扩增与目的片段的回收
• 3.2.4 目的片段的克隆及其序列分析
• 3.2.5 重组质粒的诱导表达
• 3.2.6 重组蛋白的纯化
• 3.2.7 重组蛋白的功能鉴定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 融合基因LMW/DsbA 的克隆及其序列分析
• 3.3.2 双顺反子表达载体的构建和重组子鉴定
• 3.3.3 目的基因表达产物的SDS-PAGE 和Western blot 分析
• 3.3.4 表达产物的可溶性对比分析
• 3.3.5 重组蛋白的纯化
• 3.3.6 重组蛋白的功能鉴定
• 3.4 讨论
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介