论文摘要
易栓症是指由于遗传性因素或者获得性因素导致的容易引起血栓形成和血栓栓塞的病理状态。常见的动脉血栓性疾病主要包括冠心病和急性心肌梗塞、脑血栓形成，静脉血栓性疾病主要包括深静脉血栓形成和肺血栓栓塞症。世界卫生组织的资料显示：每年我国约70万人口死于缺血性心脏病，心肌梗塞发病率为32/10万人口64/10万人口，缺血性脑卒中是我国人民致残的首要原因和致死的第二大病因。静脉血栓形成也是世界上致死和致残的主要疾病之一，在西方国家的发病率约为1/1000，总体死亡率为22.7/1000。由此可见，易栓症导致的动脉、静脉血栓性疾病，危害广泛而且严重。血栓性疾病是复杂的多基因-环境因素疾病，能够破坏血液凝血与抗凝平衡的因素均可导致血栓性疾病的发生。遗传因素决定了不同个体对血栓形成有着不同的易感性，而这种易感性是终生伴随的，在一种或多种获得性因素的诱导下容易导致血栓形成。家系分析以及孪生子研究表明，静脉血栓形成约有60%由遗传因素控制，而目前尽管冠心病、缺血性脑卒中的遗传因素所占比重尚不明确，其遗传特质亦明显。由于在血栓形成后，脏器已经缺血往往治疗效果不佳，因此，对于血栓栓塞性疾病，更重要的措施在于危险评估以及高危人群的早期预防。在这一背景下，易栓症遗传危险因素的研究可以有效的服务于普通人群和家族成员的血栓风险预测，使高危人群或亲属获益于临床前预防，并有望研发新的靶向抗凝治疗手段。在欧美国家，已经发现了与白种人群易栓症有关的2种常见遗传危险因素：Factor V Leiden多态性和Prothrombin G20210A变异。具有Factor V Leiden或者Prothrombin G20210A变异的个体患静脉血栓形成、心肌梗死、缺血性脑卒中的风险均不同程度增加。由于不同民族遗传背景的差异，这2种多态性在中国人群非常罕见。至今，尚未发现与中国人群易栓症相关的常见遗传危险因素。本课题将致力于研究中国人群易栓症的分子遗传学特点、探索与我国人群易栓症密切相关的常见遗传危险因素。鉴于目前已知的血栓风险因素都是直接或者间接引起凝血系统亢进、抗凝系统削弱而导致血液高凝和血栓形成的，本研究将较为全面的筛查参与凝血途径的各种血浆因子的异常。又因为易栓症的主要临床表现以静脉血栓形成多见，研究对象主要选择静脉血栓形成患者。由于本课题开展的一系列研究都是致力于探索中国人群易栓症的遗传易感因素，即Multiple Assessment of Genetic risk factors for thrombophiliaIn the Chinese population，简称为MAGIC研究。第一部分标本库的建立与异常血浆因子的筛查目的通过收集静脉血栓人群以及对照人群样本来建立较大规模的标本库，然后进行一系列血浆因子检测，探索可能存在的、与中国人群易栓症密切相关的常见异常因子。方法收集自2008年3月1日至2012年6月30日在湖北省血栓与止血临床医学研究中心诊治的连续性静脉血栓形成患者1034例，同时收集年龄和性别与病例组相匹配的、无血栓病史和家族史、同一地区和时间段的对照人群1334例。收集整理病例-对照人群的人口统计学资料和静脉血栓形成的获得性危险因素。从病例组人群随机选择310例进行血浆异常因子筛查，包括纤维蛋白原含量检测，凝血酶、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XI、凝血因子XII、蛋白S、蛋白C、抗凝血酶、纤溶酶原、纤溶酶原激活剂抑制物-1等因子的活性检测，狼疮抗凝物检测，以及活化蛋白C抵抗分析。结果在310例静脉血栓患者血浆的筛查试验中，有34例为蛋白C缺乏症，43例为蛋白S缺乏症，6例为抗凝血酶缺乏症、26例血浆存在狼疮抗凝物，32例为凝血因子V活性升高。其中，32例高凝血因子V活性者的血浆对活化蛋白C灭活均敏感，表明凝血因子V并无异常，可能的异常存在于其生理性抑制物，即蛋白C抗凝系统。结论与我国人群易栓症有关的常见异常因子主要有蛋白C抗凝系统（蛋白C、蛋白S、血栓调节蛋白）、抗凝血酶、狼疮抗凝物。因此，进一步的遗传学研究将选择对应的编码基因PROC、PROS1、THBD、SERPINC1、APOH为候选基因。第二部分PROC基因变异与易栓症的关联研究目的研究中国人群蛋白C缺乏症的遗传学基础，分析PROC基因可能存在的变异与易栓症的关联。方法选择血浆筛查实验发现的34例蛋白C缺乏者，进行PROC基因重测序、蛋白C活性和抗原检测。用回顾性家系分析评估优势突变对血栓形成的相对危险度。用体外重组蛋白的功能实验分析常见多态性的功能影响。采用病例-对照（1304例-1334例）研究评估优势突变和常见多态性对静脉血栓形成的优势比。结果在34例蛋白C缺乏先证者中共发现18种不同的基因突变，其中12种为首次报道。17例含有PROC c.565C>T突变，称为优势突变。具有该杂合突变的一级亲属患静脉血栓形成的风险增加8.80倍。病例组和对照组分别有68例和12例为该突变杂合子，杂合突变者患静脉血栓形成的风险增加6.44倍。研究发现PROC c.574576del是人群中一常见多态性，杂合子在病例组和对照组分别有85例和32例，杂合子患血栓形成的风险增加2.80倍。具有该多态性的杂合个体血浆PC活性采用发色底物法检测基本正常，而用凝固法检测活性仅为72.7U/dL。体外重组的变异蛋白C抗凝活性仅为正常的43.6%。结论优势突变PROC c.565C>T是我国人群遗传性蛋白C缺乏症的最常见原因，而PROCc.574576del多态性是中国人群易栓症的常见遗传危险因素。第三部分THBD基因变异与易栓症的关联研究目的研究静脉血栓人群THBD变异的遗传学特点，分析THBD基因可能存在的变异与易栓症的关联。方法在病例组人群随机选择60例，排除抗凝血酶、蛋白C、蛋白S活性下降者，进行THBD基因重测序。采用病例-对照（1304例-1334例）研究评估优势突变对静脉血栓形成的优势比；用回顾性家系分析评估优势突变对血栓形成的相对危险度。血浆游离血栓调节蛋白的检测采用ELISA法，优势突变的功能影响以荧光素酶活性实验分析。结果重测序发现5种罕见突变和1种优势突变THBD c.151G>T。具有c.151G>T杂合突变的一级亲属患静脉血栓形成的风险增加3.42倍。病例组和对照组分别有35例和13例为该优势突变杂合子，杂合突变者患静脉血栓形成的风险增加2.50倍。c.151G>T杂合子组的血浆游离血栓调节蛋白平均水平显著低于野生型组；突变型载体的荧光素酶活性也显著低于野生型载体。结论THBD c.151G>T变异引起基因的表达水平下降，THBD基因突变是中国人群易栓症的常见遗传危险因素。第四部分PROS1基因变异与易栓症的关联研究目的研究中国人群蛋白S缺乏症的遗传学基础，分析PROS1基因可能存在的变异与易栓症的关联。方法选择血浆异常因子筛查实验中发现的43例蛋白S缺乏症中的40例，进行PROS1基因重测序、蛋白S活性、蛋白S总抗原和游离抗原检测。测序未发现突变者，进行多种连接探针扩增技术分析。采用凝血酶生成实验和体外重组蛋白的功能试验分析新错义突变的功能改变。结果在40例先证者中有21例鉴别出了PROS1基因突变，共有20种不同类型的突变，其中有15种为首次报道。有18例为小型基因突变，3例为大片段缺失，剩余19例先证者未发现致栓突变。新错义突变p.Asn365Lys和p.Pro410His先证者的血浆凝血酶生成潜力等各参数均显著高于不含突变的亲属。体外实验显示p.Asn365Lys突变体的表达分泌水平略有下降，而辅因子抗凝活性明显降低；p.Pro410His突变主要导致表达和分泌水平下降，而不影响其抗凝活性。结论中国人群蛋白S缺乏症的遗传学背景具有明显的异质性，不存在引起易栓症的优势变异。第五部分SERPINC1基因变异与易栓症的关联研究目的研究中国人群抗凝血酶缺乏症的遗传学基础，分析SERPINC1基因可能存在的变异与易栓症的关联。方法选择凝血筛查试验中发现的抗凝血酶缺乏者6例，进行SERPINC1基因重测序、抗凝血酶活性和抗原检测。结果在6例先证者中共发现6种不同的基因突变，其中4例为首次报道，包括3种无义突变、2种缺失突变、1种剪切突变，均引起I型抗凝血酶缺乏症。结论中国人群抗凝血酶缺乏症的比例相对较低，遗传学背景具有明显的异质性，不存在引起易栓症的优势变异。第六部分APOH基因变异与易栓症的关联研究目的研究中国人群狼疮抗凝物产生的遗传学基础，分析APOH基因可能存在的变异与易栓症的关联。方法选择凝血筛查阶段发现的血浆含有狼疮抗凝物的血栓患者26例，进行APOH基因重测序。用PCR-限制性酶切的方法检测病例-对照（1304例-1334例）人群的APOH基因常见多态性，logistic回归分析各种单倍型对血栓形成的优势比。凝血酶生成实验分析不同单倍型的血浆凝血酶生成潜力。结果测序发现4种处于完全连锁不平衡状态的常见基因多态性g.5028C>A、c.422T>C、c.461G>A、c.1004G>C，构成3种单倍型，即野生型H1、杂合型H2、纯合性H3。H2型在病例组和对照组分别有157例和135例，H3型在病例组和对照组分别有12例和2例。H2和H3型个体患静脉血栓形成的风险分别增加1.29倍和6.04倍。H3型凝血酶生成潜力也显著高于H2和H1型。结论APOH基因单倍型是狼疮抗凝物产生的遗传易感因素，也是中国人群易栓症的常见遗传危险因素。
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