湖南省柑橘类病毒的检测与分子分型研究

论文摘要

早在19世纪70年代国外就已对柑橘类病毒进行了调查研究,现已鉴定了多种柑橘类病毒,并已将不引起柑橘病害症状且又具有矮化作用的柑橘类病毒应用于商业化的矮化密植生产。而中国虽是世界柑橘原产地和生产大国,栽培历史悠久,栽培面积广泛,品种资源丰富,但对本国内柑橘类病毒资源情况了解较少,有关柑橘类病毒的研究报道也仅集中在柑橘裂皮病的调查与检测。湖南是柑橘的原产地,栽培历史悠久,种植面积广,是国内的柑橘生产大省。本研究旨在对湖南省各柑橘栽培地区的柑橘类病毒进行调查,采集柑橘枝条（1-2年生）样品,对其所含有的柑橘类病毒进行检测和初步应用研究,主要研究结果如下:1、建立了柑橘类病毒CEVd、CVd-Ⅰ、CVd-Ⅱ、CVd-Ⅲ和CVd-Ⅳ的RT-PCR检测体系,检测到了4种柑橘类病毒（CEVd、CVd-Ⅰ、CVd-Ⅱ和CVd-Ⅲ）,其中CVd-Ⅱ和CVd-Ⅲ为首次在国内报道。采用sPAGE（Sequential Polyacrylamide GelElectrophoresis）垂直电泳技术检测部分样品中所含有的类病毒。2、将部分检测含有CVd-Ⅱ或CVd-Ⅲ,或同时含有CVd-Ⅱ和CVd-Ⅲ的枝条样品嫁接于Etrog枸橼,保存于温室内。3、对部分样品检测到的柑橘类病毒进行了全序列克隆,并测序,获得柑橘类病毒全序列。运用DNAMAN软件和Blast将所测序列与Genbank已登录序列进行序列比对分析,分析序列特征和柑橘类病毒亚型。本实验检测到的CVd-Ⅲ大多数为CVd-Ⅲb,检测到的CVd-Ⅱ有些可能是新的亚型。4、对含有有益矮化柑橘类病毒但又混合感染其它类病毒的样品进行接种纯化试验,纯化出有益矮化柑橘类病毒（如CVd-Ⅱa、CVd-Ⅲb等）,以及具有不同序列特征的湖南省所特有的柑橘类病毒资源。同时对部分样品进行矮化试验,长沙样品（Y1、Y2、Y3和Y4）的矮化明显。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1 类病毒研究进展
• 1.1 类病毒的发现
• 1.2 类病毒的结构
• 1.2.1 一级结构
• 1.2.2 二级结构
• 1.3 类病毒的复制
• 1.3.1 类病毒的位置
• 1.3.2 类病毒的复制
• 1.4 类病毒的分类
• 1.5 类病毒的病害
• 1.6 类病毒的防治
• 1.6.1 类病毒的传播
• 1.6.2 类病毒的防治
• 2 柑橘类病毒研究进展
• 2.1 柑橘类病毒
• 2.2 柑橘裂皮病类病毒（CEVd）
• 2.2.1 发生与危害
• 2.2.2 病原
• 2.2.3 致病机理
• 2.2.4 株系分化
• 2.2.4 寄主范围、症状表现及其传播途径
• 2.2.6 检测及脱毒
• 2.2.7 防治措施
• 2.3 柑橘类病毒CVdⅠ
• 2.4 柑橘类病毒CVdⅡ（HSVd）
• 2.5 柑橘类病毒CVdⅢ
• 2.6 柑橘类病毒CVd-Ⅳ
• 2.7 柑橘类病毒CVd-OS
• 2.8 柑橘类病毒应用
• 3 植物类病毒检测技术研究进展
• 3.1 生物学检测
• 3.2 电子显微镜观察
• 3.3 分子生物学检测
• 3.3.1 RT-PCR检测
• 3.3.2 mRT-PCR检测
• 3.3.3 分子杂交检测
• 3.4 电泳检测
• 4 研究的目的和意义
• 第二章 柑橘类病毒的调查与分子分型
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 主要试剂和仪器
• 1.1.3 引物的设计与合成
• 2 方法
• 2.1 柑橘核酸RNA的提取
• 2.1.1 用于RT-PCR分析的RNA提取
• 2.1.2 用于sPAGE垂直电泳的类病毒总RNA的提取
• 2.2 柑橘类病毒的RT-PCR扩增检测
• 2.3 柑橘类病毒的sPAGE检测
• 2.4 柑橘类病毒的生物学检测
• 2 结果与分析
• 2.1 柑橘RNA的提取
• 2.2 柑橘类病毒的RT-PCR分析
• 2.2.1 RT-PCR检测CEVd
• 2.2.2 RT-PCR检测CVd-Ⅰ（CBLVd）
• 2.2.3 RT-PCR检测CVd-Ⅱ（HSVd）
• 2.2.4 RT-PCR检测CVd-Ⅲ
• 2.2.5 RT-PCR检测CVd-Ⅳ及其他柑橘类病毒
• 2.3 生物学检测
• 2.4 柑橘类病毒的sPAGE检测
• 3 讨论
• 第三章 柑橘类病毒全序列克隆及序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 试剂及仪器
• 1.3 RT-PCR扩增产物的纯化
• 1.4 纯化产物的克隆、测序
• 1.4.1 PCR扩增片段的克隆
• 1.4.2 鉴定携带重组质粒的克隆
• 1.4.3 阳性克隆测序
• 1.5 生物信息学分析
• 2 结果与分析
• 2.4 柑橘类病毒的序列同源性分析
• 2.4.1 柑橘裂皮病（CEVd）的克隆及序列分析
• 2.4.2 柑橘CVdⅡ型类病毒的克隆及序列分析
• 2.4.3 柑橘CVdⅢ型类病毒的克隆及序列分析
• 3 讨论
• 3.1 类病毒的克隆
• 3.2 类病毒序列分析
• 第四章 柑橘类病毒的纯化及初步矮化试验
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 柑橘类病毒的保存与纯化
• 1.3 柑橘类病毒的矮化
• 2 结果与分析
• 2.1 柑橘类病毒接种纯化
• 2.2 柑橘类病毒初步矮化试验
• 3 讨论
• 3.1 接种试验
• 3.2 纯化途径
• 3.3 矮化试验
• 全文总结
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简历