肺癌A549细胞趋电性及其发生机制的实验研究

论文摘要

【背景】在美国,肺癌是因癌症而死亡的首要原因,其中男性肺癌死亡人数占癌症死亡人数的31%,女性肺癌死亡人数占癌症死亡人数的26%,且女性的这个比例还在攀升。尽管临床治疗取得了不断进步,但肺癌总体5年存活率仅为16%。在我国,肺癌的年死亡人数在不断增长,仅2005年就约有42900人死于肺癌,其中转移是肺癌死亡的首要原因。癌细胞转移分为如下几个阶段,首先癌细胞脱离原瘤体,然后癌细胞穿透血管壁,最后转移至其它部位。细胞迁移是癌转移过程的重要环节,且转移依赖于细胞迁移能力的增强。目前,癌细胞趋化性迁移已得到了广泛深入的研究,而由内源性或外源性电场所诱发的癌细胞趋电性迁移还仍是一个崭新的课题。正常组织表面存在着跨上皮电势（transepithelial potential, TEP）,其强度在数毫伏到数十毫伏之间不等。人气管及支气管的粘膜上皮均存在TEP,大小在10-14mV之间。当肺癌细胞突破支气管上皮组织后,上皮细胞层出现缺损,TEP便驱使带电离子流动,损伤的上皮就会产生内生电场,使肺癌细胞暴露于内生电场中。多种细胞在体外直流电场中具有趋电性,但并不是所有细胞都有这一性质,且不同细胞趋电迁移方向也不同。人角膜细胞、视网膜色素上皮细胞及角质细胞在外加直流电场中朝负极迁移,而人粒细胞及血管内皮细胞在外加直流电场中则朝正极迁移。目前对癌细胞的趋电性机制还知之甚少。Djamgoz等最新研究发现,恶性程度较高的大鼠前列腺癌细胞表有较强的定向迁移能力,而恶性程度较低的前列腺癌细胞在相同外加直流电场中则没有表现出趋电迁移的特性,二者对直流电场的反应差别巨大,但具体机制不详。研究发现,在1.5V/cm的体外直流电场中,表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptors, EGFRs）对角膜上皮细胞的定向迁移起着关键的作用。同时,EGFRs的激活与极化也是角质细胞定向迁移所不可或缺的。在角质细胞及中性粒细胞中,电场通过PI（3）Kγ及PTEN信号调解细胞的趋电迁移。另一方面,已知PI（3）Kγ及PTEN是EGFRs下游信号的重要调节分子。EGFRs调节多种癌细胞的趋化迁移,对乳腺癌的趋电迁移也起重要作用,然而对肺癌细胞的趋电性影响尚未见研究报道。细胞骨架是细胞内运动、细胞器固定、细胞外型维持、细胞迁移、信号转导和细胞分裂的物质基础之一。整合素β1（Integrinβ1）是一类重要的细胞表面受体,可诱导细胞骨架的重排,同时双向传导细胞内外的信号,从而广泛影响细胞的存活、生长、分化、侵袭和转移等生物学行为。整合素与细胞支架是紧密连接的,且二者之间存在着双向信号传递,共同影响一系列生物学行为。局部粘附激酶（focal adhesion kinase, FAK）是细胞内一种非受体型酪氨酸激酶,是整合素介导的胞外-胞内信号传导通路的基础性信号传递分子。它与整合素受体相连接并聚集其它分子于连接位点,形成信号复合体,将细胞外信号向细胞骨架传递,调节细胞的粘附、迁移。目前,Integrinβ1及FAK对肺癌细胞趋化性的研究是一热点,但尚未见二者对细胞趋电性影响的报道。PTEN （phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten）是第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因,不仅含有与蛋白酪氨酸磷酸酶和蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶催化中心同源的序列,具有蛋白磷酸酶作用,同时还表现出脂质磷酸酶作用,故称之为双重特异性磷酸酶,可通过抑制细胞内PI3K-AKT、Ras-MAPK-ERK及Integrin-FAK信号传导途径阻滞细胞周期,抑制细胞的生长发育、诱导凋亡、抑制细胞的迁移、铺展和局部粘附等功能。目前,PTEN对细胞的趋电性影响重要性已开始被学者认识。【目的】建立电场对人肺癌A549细胞的体外作用模型,观察电场对A549细胞生物学效应如凋亡、增生、形态及迁移的影响,并检测在电场效应中EGF-EGFR、细胞骨架蛋白、整合素、PTEN及相关信号通路的变化及相应调节作用。【方法】1)按文献建立电场对人肺癌A549细胞作用模型观察体外直流电场对A549细胞凋亡、增生、形态及迁移的影响:（1）按A549肺癌细胞是否暴露于1V/cm直流电场及暴露时间分为A,B,C三组,A组为未暴露电场的对照组,B组暴露于电场12h,C组暴露于电场24h。Hochest33258荧光染色及流式细胞仪检测各组细胞的凋亡值及凋亡率。流式细胞仪检测各组的细胞周期,Western blot检测各组细胞中ERK、AKT及二者矿磷酸化形式pERK、pAKT的量,同时检测各组细胞中细胞周期蛋白cyclin D1与cyclin E,细胞周期抑制蛋白P21与P27的表达量。（2）将A549肺癌细胞暴露于强度分别为2V/cm、4V/cm、6V/cm及8V/cm的直流电场,观察记录每5min细胞移行的方向和变化,测量其移行轨迹总长度、位移距离、速率及方向系数,共3h。并与未暴露于电场的A549肺癌细胞作为对照。2)观察EGF及EGFR对A549肺癌细胞趋电性的影响:（1）按A549细胞是否暴露于直流电场及是否给予EGF分为A,B,C,D四组,A组为对照组,B组为20μg/L EGF处理组,C组为6V/cm电场刺激组,D组为20μg/L EGF+电场组。显微摄像系统每15min连续记录2h内细胞迁移的变化图像,测量细胞迁移距离及细胞迁移方向与电场方向间夹角cosineγ值, Image-Pro Plus5.0软件处理结果;Western blot检测各组细胞中p-ERK及p-stat 3的表达量。（2）按A549肺癌细胞是否暴露于直流电场及是否给予EGFR抑制剂AG1478及Cetuximab分为A,B,C,D,E,F六组:A组为对照组（0V/cm）,B组为电场组（3V/cm）,C组为Cetuximab组（0V/cm）,D组为Cetuximab +电场组（3V/cm）,E组为AG1478组（0V/cm）,F组为AG1478 +电场组（3V/cm）。连续测量各组移行的位移距离、速率及方向系数2h,细胞免疫荧光染色检测EGFR及F-actin在A549细胞上的分布,Western blot检测EGFR下游相关蛋白的表达。3)直流电场对肺癌细胞骨架蛋白和整合素的影响:按A549肺癌细胞是否暴露于直流电场、暴露时间及是否给予细胞松弛素B（cytochalasin B）分为A,B,C,D,E,F六组,A组为对照组,B组暴露于体外5V/cm直流电场1h,C组暴露于体外5V/cm直流电场2h,D组同C组处理后去除电场再培养2h,E组暴露于cytochalasin B （2mg/L）2h,F组同时暴露于cytochalasin B（2mg/L）及体外直流电场（5V/cm）刺激2h。测量各组移行指标,间接免疫荧光染色检测Integrinβ1及β-tubulin在A549细胞上的分布,直接荧光染色检测F-actin在A549细胞上的分布,Western blot检测Integrinβ1下游信号通路相关蛋白的表达。4) PTEN基因转染A549肺癌细胞对趋电性影响脂质体转染法将PTEN的真核表达载体及其空载体转染入A549细胞,经G418 （600μg/ml）筛选后获稳定的克隆并鉴定;挑选细胞克隆并扩大培养,按A549细胞是否被转染及转染质粒的不同分为3组: A组为未转染A549细胞对照组,B组为空载体pEGFP-C1转染的A549细胞组,C组为pEGFP-C1-PTEN转染的A549细胞组。各组均置于3V/cm的直流电场,每15min连续显微摄像记录2h内细胞移行的变化图像,测量细胞移行距离及细胞移行与电场方向间夹角cosineγ值;Western blot检测各组细胞中pFAK、pERK及pAKT的表达量。【结果】1)成功建立了体外直流电场对人肺癌A549肺癌的作用模型,各电场参数稳定,重复性好。（1）,荧光染色结果显示A、B、C三组凋亡细胞率分别为0.40%、0.43%及0.52%,无显著差异（P>0.05）。流式细胞结果显示A、B、C三组凋亡细胞比率分别为0.61%、0.82%及0.68%,无显著差异（P>0.05）;与A组细胞相比, B、C2组细胞周期增殖期S期和G2期的比例明显升高,二组增殖指数分别升高9.72%及20.08%。Western blot检测提示电场促进ERK与AKT蛋白磷酸化水平,同时促进细胞周期蛋白cyclin D1与cyclin E的表达,抑制了细胞周期抑制蛋白P21与P27的表达。（2）,未暴露于直流电场中的A549细胞在观察期间无明显运动,3h后细胞形态未见明显改变。而暴露于不同强度电场中的各组细胞则呈现两种有规律的变化:①大部分细胞由扁圆形变为纺锤形,长轴趋向垂直于场线方向排列;②细胞向阴极方向定向运动,且这种运动速度随电场增大而加快（P<0.05）,细胞迁移的方向系数（cosineγ）随暴露时间的延长而增大（P<0.05）。2) （1）未暴露于直流电场中的A,B组细胞则呈现出无序随机的细微运动,暴露于直流电场中的C,D组细胞在观察期间呈现向阴极方向定向迁移,D组细胞的定向移行cosineγ值最大（0.83±0.03,P<0.05）,定向移行距离更长（63±16.9μm,P<0.05）。Western blot检测提示电场及EGF均促进p-ERK及p-stat 3的表达,电场及EGF共同作用组其表达最强。（2）未暴露于3V/cm电场中的A,C,E三组A549细胞呈无序随机的细微运动,而暴露于相同电场的B,D,F三组细胞表现出向阴极定向迁移的运动,Cetuximab（4 nM）及AG1478（8μM）均使A549细胞在电场中的定向迁移减弱（P<0.01）。暴露于3V/cm电场2h,EGFR及F-actin在细胞膜阴极面呈强荧光染色,电场使pERK及pAKT蛋白表达量快速成倍升高,Cetuximab（4 nM）及AG1478（8μM）均使电场对ERK及AKT磷酸化的促进作用减弱,但二者不能完全阻断这种促进作用。3)暴露于5V/cm电场中A549细胞持续向电场阴极定向迁移,停止电场干预后迁移细胞不再呈现定向迁移趋势,2h内细胞形态恢复至正常扁圆形, Integrinβ1、F-actin及β-tubulin在细胞阴极面呈强荧光染色。细胞松弛素B使正常A549细胞失去原有的立体结构而变得更加扁平,暴露于电场后A549细胞亦无明显定向迁移趋势,Integrinβ1及F-actin持续呈现沉积样分布,未见荧光强度和分布的变化。4) PTEN基因可经脂质体转染入A549细胞,可建立稳定转染的PTEN-A549细胞系,转染有PTEN的A549细胞在电场作用前后细胞形态未发生明显变化,未转染PTEN基因的A,B两组细胞朝向电场阴极定向迁移,平均细胞位移距离ATLD分别为26±5.9μm和28±5.1μm,ΣNcosγ/N分别为0.78±0.15和0.76±0.11,而转染PTEN基因的C组只呈现出微弱的定向迁移趋势,ATLD及ΣNcosγ/N分别为5±1.9μm和0.21±0.18。C组与A,B两组比较,ATLD及ΣNcosγ/N均存在显著差异（P<0.001）。Western blot检测结果显示,各组细胞置于3V/cm直流电场后,未转染PTEN基因的A,B两组A549细胞pFAK、pERK、pAKT表达量明显升高,而转染PTEN基因的C组A549细胞pFAK、pERK、pAKT表达量无明显变化。【结论】1)肺癌A549细胞暴露于1V/cm的体外直流电场后,凋亡率无变化,而细胞周期明显改变,且细胞增殖更为活跃,此变化可能与电场激活了ERK与AKT信号通路,从而影响细胞周期相关蛋白有关。体外直流电场可诱导人肺癌细胞系A549细胞向阴极定向移行,此作用与电场强度有关,其移行速率在1h后与暴露时间延长无关。2) EGF可以促进体外直流电场诱导人肺癌A549细胞朝阴极定向移行,EGFR在电场中极化并激活其下游信号转导通路,这可能在肺癌细胞趋电迁移中起关键作用。相关信号转导通路可能涉及Akt、ERK及Stat通路。3)肺癌A549细胞的在电场中的定向移行依赖于电场的维持,细胞骨架蛋白及整合素在电场中极化,Integrin-FAK-ERK通路可能对肺癌A549细胞的趋电性起关键作用。4) PTEN可以明显抑制A549细胞的趋电性。电场作用后A549细胞中FAK、ERK及AKT磷酸化水平的上调能够被PTEN阻断。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 第一部分 细胞迁移与肺癌转移
• 第二部分 生理范围电场与细胞生物学效应的研究现状
• 正文
• 实验一 直流电场对肺癌细胞凋亡、细胞周期及迁移的影响
• 1 材料和方法
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验二 直流电场中EGF-EGFR对肺癌细胞定向迁移的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验三 直流电场对肺癌细胞骨架蛋白和整合素的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验四 PTEN对人A549 细胞趋电性的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 个人简历和研究成果
• 致谢