猪细小病毒PPV2010株的分离及基因组演化分析

论文摘要

猪细小病毒病是由猪细小病毒（PPV）引起的一种以母猪流产、胎儿死亡、胎儿畸形、木乃伊化及弱胎为主要特征的猪的繁殖障碍性疾病。该病在世界范围内流行,严重地影响了养猪业的发展。本研究对吉林地区一猪场的一批流产母猪进行了病料采集,在PK-15细胞上进行了病毒的分离,经盲传后,病毒可在PK-15细胞上产生明显的病变,经电镜观察和免疫荧光鉴定,证明所分离到的病毒为PPV,将分离到的病毒命名为PPV2010。根据GenBank上已经公布的PPV序列设计了5对特异性引物,每段引物所扩增的片段在起始和末尾处相互重叠,得到的5个PCR产物,分别经胶回收后连接pMD18-T载体,重组质粒经酶切鉴定正确后测序,所得结果利用DNASTAR软件进行全长序列的拼接,将PPV2010全长序列上传至GenBank,获得序列号JN872448。收集了GenBank上公布的PPV全长、NS1基因和VP2基因的序列,先经MUSCLE比对,再经Se-Al手工比对,利用ModelTest3.7计算得到所有数据组的最适核苷酸替代模型均为GTR+G+I.利用PAUP4.0进行了系统发生树的构建。利用DNASTAR软件比较了各毒株间的核苷酸和氨基酸同源性。研究结果表明PPV2010株与BQ株的同源性最高。利用RDP对PPV的重组进行了分析,结果显示在PPV的进化过程中并没有发生重组事件。对PPV的MCC tree构建结果显示PPV是一种大概在164年（95%HPD:55-397）以前就已经存在的病毒。本研究获得的病毒为PPV进一步生物学研究提供了实验材料,同时对PPV的进化分歧时间得出了新的结论。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1. 引言
• 1.1 猪细小病毒概述
• 1.1.1 流行病学
• 1.1.2 临床症状及病理变化
• 1.2 病原学研究
• 1.3 分子生物学研究
• 1.3.1 猪细小病毒基因组结构
• 1.3.2 猪细小病毒的DNA复制
• 1.3.3 猪细小病毒基因组的转录
• 1.3.4 猪细小病毒的蛋白与功能
• 1.4 猪细小病毒检测方法的研究
• 1.4.1 分离鉴定
• 1.4.2 血清学检测
• 1.4.3 分子生物学检测
• 1.5 猪细小病毒疫苗的研究
• 1.5.1 传统疫苗
• 1.5.2 基因工程疫苗
• 1.6 研究目的与意义
• 2. 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株与载体
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 标准参照物
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 猪细小病毒的分离与鉴定
• 2.2.2 猪细小病毒序列的测定
• 2.2.3 猪细小病毒的演化分析
• 3. 结果
• 3.1 组织样品中猪细小病毒的鉴定
• 3.2 病毒的分离结果
• 3.3 分离的猪细小病毒鉴定结果
• 3.3.1 电镜形态学观察结果
• 3.3.2 间接免疫荧光鉴定结果
• 3.3.3 PCR鉴定结果
• 3.4 猪细小病毒全长基因的测定
• 3.4.1 猪细小病毒全长基因的PCR扩增结果
• 3.4.2 PCR产物连接T载体后质粒的鉴定
• 3.4.3 猪细小病毒PPV2010株全长基因的拼接
• 3.5 猪细小病毒的演化分析
• 3.5.1 最适核苷酸替代模型的选择
• 3.5.2 猪细小病毒与其他细小病毒科病毒的关系
• 3.5.3 不同猪细小病毒毒株间核苷酸和氨基酸的同源性
• 3.5.4 猪细小病毒重组的检测结果
• 3.5.5 核苷酸替代率的计算
• 3.5.6 病毒分歧时间的计算
• 3.5.7 压力选择的分析
• 4. 讨论
• 4.1 病毒分离
• 4.2 分离猪细小病毒的鉴定
• 4.3 猪细小病毒全长序列的克隆与测定
• 4.4 猪细小病毒的演化分析
• 4.4.1 进化树的构建
• 4.4.2 病毒的重组分析
• 4.4.3 核苷酸替代率和分歧时间的分析
• 4.4.4 压力选择的分析
• 5. 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文