DNA-PK的表达与肿瘤细胞增殖的关系及对DNA损伤药物敏感性的影响的研究

论文摘要

目的:通过检测DNA依赖蛋白激酶（DNA-PK）的调节亚单位Ku70和催化亚单位DNA-PK cs在卵巢癌组织中和肿瘤细胞株中的表达,并观察用RNA干扰技术降调节Ku70和DNA-PK cs基因的表达后肿瘤细胞增殖性和细胞周期变化和对某些化学药敏感性的变化,以了解DNA损伤修复途径NHEJ（nonhomologous ending-joining）在肿瘤的发生、发展和肿瘤细胞耐药的产生过程中的作用,探讨将DNA-PK作为提高化疗敏感性,减少耐药发生的分子靶点的可能性。方法:采用免疫组织化学S-P法测定正常卵巢、卵巢良性肿瘤、卵巢初发癌和复发癌组织中以及卵巢癌细胞株A2780和宫颈癌细胞株HeLa中Ku70和DNA-PKcs的表达;用基因重组技术将根据Ku70和DNA-PKcs的基因设计合成的可形成DNA-PK短发卡结构的DNA片段插入真核表达质粒,构建Ku70和DNA-PK cs短发卡RNA表达质粒pSIRENKu70shRNA和pSIRENDNA-PKcsshRNA,经双酶切鉴定和DNA测序证实,将构建成功的重组质粒用脂质体转染的方法分别转染表达Ku70和DNA-PKcs的卵巢癌A2780细胞和宫颈癌HeLa细胞,产生RNA干扰（RNA interference,RNAi）作用使Ku70或DNA-PKcs基因特异性转录后沉默;用逆转录PCR（RT-PCR）测定转染前后Ku70和DNA-PKcsmRNA的水平;免疫印迹法（Western-blot）测定基因转染前后Ku70和DNA-PKcs蛋白的表达;四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT）和流式细胞技术（FCM）测定转染前后细胞的生存率及细胞周期分布和凋亡率,以及转染细胞与未转染细胞用顺铂、足叶乙甙或拓扑替康前后的IC50的变化。结果:Ku70和DNA-PKcs在正常卵巢、卵巢囊腺瘤和卵巢癌组织中都有不同程度的表达,两者在卵巢癌的表达阳性率明显高于卵巢囊腺瘤和正常卵巢组织（P<0.01）,经统计学检验,两者在卵巢癌的表达的一致性好,虽然DNA-PKcs的阳性率低于Ku70,但差异无统计学意义（P>0.01）。不同组织类型的卵巢癌DNA-PKcs和Ku70的表达无差异。初发癌组织DNA-PKcs表达中阳性及强阳性（++-+++）为36%（13/36）,复发后癌组织DNA-PKcs表达中阳性及强阳性（++-+++）为83%（30/36）,复发癌组织较初发癌组织DNA-PKcs中阳性和强阳性表达明显增加（×2=16.686,P<0.01）;复发前后自身比较,复发较初发DNA-PKcs表达增强29例,无变化5例,1减弱2例,配对秩和检验,差异有极显著性（Z=-4.630,P<0.01）,复发后癌组织中DNA-PKcs表达较初发时明显增高,这种表达的变化与肿瘤初发时的病理类型、病理分级和临床分期无关。初发癌组织中Ku70表达中阳性及强阳性（++-+++）为56%（20/36）复发后癌组织Ku70表达中阳性及强阳性（++-+++）为69%（25/36）,复发癌组织较初发癌组织Ku70中阳性和强阳性表达增加,但无统计学意义（×2=1.481,P>0.01）,复发前后自身比较,复发较初发Ku70表达增强14,无变化20,减弱2,配对秩和检验,差异无统计学意义（Z=-2.078 P>0.01）。DNA测序分析证实成功构建了Ku70shRNA和DNA-PKcs shRNA重组表达载体pSIRENKu70shRNA和pSIRENDNA-PKcs shRNA,并成功转染A2780细胞和HeLa细胞,转染重组载体的A2780细胞和HeLa细胞Ku70和DNA-PKcs的表达在mRNA和蛋白水平均明显下降,其中pSIRENKu70shRNA1和pSIRENDNA-PKcs shRNA2有更好的抑制效率;转染pSIREN组与未转染组比较细胞生存率、各细胞周期变化及凋亡率差异无统计学意义（P>0.01）,转染重组载体pSIRENKu70shRNA1和pSIRENDNA-PKcs shRNA2细胞增殖活性较转染pSIREN组均降低,转染后较转染前S期细胞增多,G1期细胞减少,A2780细胞和HeLa细胞结果一致。A2780和heLa两株细胞转染重组质粒后,对DDP和VP-16的敏感性均较未转染细胞明显增加（P<0.01）,转染pSIREN-Ku70shRNA1与转染pSIREN-DNA-PKcsshRNA2结果是一致的。转染重组质粒的细胞对TPT敏感性的变化两株肿瘤细胞的结果不一致,A2780细胞转染pSIREN-Ku70shRNA1或转染pSIREN-DNA-PKcsshRNA2后细胞对TPT的敏感性无明显变化,HeLa细胞转染后较转染前细胞对TPT的敏感性明显增加（P<0.01）,转染pSIREN-Ku70shRNA1和转染pSIREN-DNA-PKcs shRNA2的结果是一致的。结论:1、Ku70和DNA-PKcs在卵巢癌组织中的表达均高于正常卵巢组织和卵巢囊腺瘤,两者的表达是一致的,卵巢癌细胞的DNA修复能力是增强的。2、DNA-PKcs在复发癌组织中的表达较初发癌明显增高,Ku70的变化无统计学意义,提示DNA-PKcs在卵巢癌耐药的发生中可能起重要作用。在卵巢癌的化疗过程中肿瘤细胞的NHEJ的DNA修复能力是增强的,这可能是卵巢癌顺铂耐药产生的重要机理之一。3、选择靶基因的19碱基为模板合成63bp含有loop结构的双链DNA链插入质粒中,用脂质体将重组质粒转入在肿瘤细胞中,在细胞内合成双链小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）发挥确切的RNA干扰作用使靶基因沉默,用这种方法设计的pSIREN-Ku70shRNA1和pSIREN-DNA-PKcs shRNA可以较好地抑制Ku70和DNA-PKcs的表达。4、DNA-PK表达的抑制可能会导致肿瘤细胞增殖活性降低和细胞周期分布的变化。5、Ku70或DNA-PKcs的降调节均可使A2780细胞和HeLa细胞对顺铂、足叶乙甙的敏感性增加,但是否能增加对TPT的敏感性不确定。DNA-PK这一DNA修复途径NHEJ的关键酶不仅与肿瘤的发生发展有关,而且其功能的强弱可能影响肿瘤细胞对某些导致DNA损伤的化疗药物的敏感性,对DNA-PK的深入研究可能为肿瘤化疗的增敏和耐药性的逆转提供有效的分子靶点。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 正文
• 前言
• 第一部分 DNA-PK在卵巢癌及复发卵巢癌组织中的表达
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 附图
• 第二部分 DNA-PKshRNA真核表达质粒的构建及在肿瘤细胞中的表达
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 附图
• 第三部分 DNA-PK基因表达的抑制与肿瘤细胞对DNA损伤药物敏感性的关系
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 综述 DNA-PK与肿瘤
• 攻读博士学位期间完成及发表的论文
• 致谢