降解有机磷农药的细胞表面展示工程菌的构建及性能分析

论文摘要

有机磷农药在农业生产中得到了广泛使用,但是其高毒、高残留等不利因素也给人类健康和生态环境带来巨大威胁。环境中有机磷农药的降解主要是靠微生物进行。从黄杆菌（Flavobacterium sp.ATCC 27551）和缺陷假单胞菌（Pseudomonasdiminuta MG）中分离纯化出的有机磷水解酶（organphosphorus hydrolase,OPH）以及克隆到的基因opd,在有机磷降解中研究得最为深入。利用传统的DNA重组技术构建的基因工程菌,往往因细胞内表达的有机磷水解酶不能与胞外底物充分接触而限制了酶活性的发挥。最近发展起来的细胞表面展示技术可将有机磷水解酶分泌并固定到细胞外表面,为开发具有高催化活性且价格低廉的活细胞生物催化剂提供了新思路。本课题研究包括三方面:1.冰核活性细菌的分离鉴定,从植物冻伤组织中分离到一株具有冰核活性的细菌HY-1,经鉴定发现该菌株为革兰氏阴性,短杆状,极生鞭毛,严格好氧,具有运动性。HY-1具有明显的冰核活性,在-8℃下2 min内液滴平均结冰率高达92.5%。经生理生化实验和16S rDNA测序分析初步鉴定为假单胞菌属,系统发育树分析结果发现该菌与荧光假单胞菌亲缘关系最近。2.利用丁香假单胞菌（P.syringae KTCT1832）的冰核蛋白（ice nucleationprotein,INP）N-末端作为锚定单元构建了表面展示有机磷水解酶大肠杆菌基因工程菌（MMBL-405）,由启动子Ptrc启动融合蛋白INPN-OPH的表达。全细胞SDS-PAGE电泳分析发现工程菌表达的融合蛋白分子量为57 ku。全细胞酶活性分析发现工程菌在20℃下添加IPTG至终浓度为0.1mmol/L,诱导8h,获得全细胞最高酶活性,酶活性为0.6168 U/mg细胞干重。蛋白酶K实验的结果表明有91%的全细胞酶活性展示在细胞表面。比文献报道的大肠杆菌细胞表面展示的OPH的最高酶活性高13倍。3.将融合基因连接到广宿主表达载体pYMBP上转化到野生型恶臭假单胞菌（P.putida AB92019）中构建了能够组成型表达有机磷水解酶的表面展示工程菌（MMBL-opd）。由启动子PoprL启动融合蛋白INPN-OPH的持续表达,全细胞SDS-PAGE电泳分析发现工程菌表达了分子量约为80 ku的融合蛋白。全细胞酶活性分析发现工程菌在28℃下培养48 h,可获得最大全细胞酶活性,对应为0.0363U/mg细胞干重。蛋白酶K实验表明有93%的全细胞酶活性定位在细胞表面。工程菌在无抗性平板上连续培养7天,质粒的携带率仍为100%。在4℃放置30天,全细胞酶活性仍能保持93%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 有机磷农药研究综述
• 1.1.1 有机磷农药概述
• 1.1.2 有机磷农药的化学组成和分类
• 1.1.3 常用的有机磷农药的理化特性
• 1.1.4 有机磷农药的危害性
• 1.1.5 有机磷的作用机理
• 1.1.6 有机磷在自然环境中的降解
• 1.1.6.1 光降解
• 1.1.6.2 碱水解
• 1.1.6.3 植物降解
• 1.1.6.4 微生物降解
• 1.1.7 有机磷的降解途径
• 1.2 降解有机磷的酶学研究
• 1.2.1 OPH的酶学研究进展
• 1.2.1.1 OPH的蛋白质序列和结构分析
• 1.2.1.2 金属离子取代分析
• 1.2.1.3 催化机制
• 1.2.1.4 活性位点分析
• 1.2.1.5 底物特异性分析
• 1.2.2 其它有机磷水解酶的研究
• 1.2.3 有机磷水解酶的基因研究
• 1.2.4 有机磷水解酶的改造
• 1.2.5 有机磷水解酶的应用研究进展
• 1.2.5.1 重组菌的构建
• 1.2.5.2 酶的固定化
• 1.2.5.3 生物传感器的设计
• 1.3 表面展示技术在有机磷降解中的应用进展
• 1.3.1 表面展示技术简介
• 1.3.2 表面展示锚定单元研究进展
• 1.3.3 有机磷水解酶的表面展示系统
• 1.3.4 表面展示有机磷水解酶的应用
• 1.3.4.1 重组菌的构建
• 1.3.4.2 表面展示与OPH的固定化
• 1.3.4.3 利用表面展示筛选OPH改良的突变体
• 1.3.4.4 利用表面展示的OPH构建生物传感器
• 1.3.4.5 其它有机磷降解酶的表面展示
• 1.4 课题研究的目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 冰核细菌筛选材料
• 2.1.2 菌株与质粒
• 2.1.3 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）引物
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 试剂及仪器
• 2.1.5.1 试剂
• 2.1.5.2 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 冰核细菌的分离及鉴定
• 2.2.1.1 从植物冻伤组织中分离冰核细菌
• 2.2.1.2 冰核活性测定
• 2.2.1.3 冰核细菌鉴定
• 2.2.1.4 16S rDNA测序分析
• 2.2.2 大肠杆菌细胞表面展示系统的构建
• 2.2.2.1 opd基因的PCR扩增
• 2.2.2.2 酶切与酶连
• 2.2.2.3 大肠杆菌感受态的制备与转化
• 2.2.2.4 SDS-PAGE分析
• 2.2.2.5 全细胞酶活性测定
• 2.2.2.6 表面展示OPH全细胞酶活性分析
• 2.2.2.7 蛋白酶K敏感性实验
• 2.2.3 假单胞菌表面展示体系的构建
• 2.2.3.1 质粒pOpr-nopd的构建
• 2.2.3.2 假单胞菌感受态制备与转化
• 2.2.3.3 全细胞酶活条件分析
• 2.2.3.4 SDS-PAGE电泳 方法参见2.2.2.4
• 2.2.3.5 全细胞酶活测定 方法参见2.2.2.5
• 2.2.3.6 蛋白酶K敏感性分析 方法参见2.2.2.7
• 2.2.3.7 质粒稳定性与酶活稳定性分析
• 3 结果与分析
• 3.1 冰核活性细菌的分离与鉴定
• 3.1.1 冰核细菌的分离
• 3.1.2 冰核活性细菌筛选
• 3.1.3 冰核活性细菌的鉴定
• 3.1.3.1 形态学观察
• 3.1.3.2 生理生化实验
• 3.1.3.3 16S rDNA PCR结果分析
• 3.2 大肠杆菌表面展示体系的构建
• 3.2.1 质粒pMPL405的构建
• 3.2.2 全波长扫描图谱
• 3.2.3 SDS-PAGE电泳分析
• 3.2.4 全细胞酶活性分析
• 3.2.5 表面展示的OPH细胞定位
• 3.2.6 酶活性比较
• 3.3 假单胞菌细胞表面展示系统的构建
• 3.3.1 假单胞菌表达质粒pOpr-nopd的构建
• 3.3.2 SDS-PAGE分析
• 3.3.3 融合蛋白的全细胞酶活性分析
• 3.3.4 OPH在细胞表面的定位分析
• 3.3.5 质粒稳定性和酶活稳定性分析
• 3.4 小结
• 4 讨论
• 4.1 冰核细菌的种类及冰核蛋白的结构特点
• 4.2 表面展示单元与宿主菌
• 4.3 启动子POPRL
• 4.4 后续工作展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录