论文摘要
研究背景含马兜铃酸（AA）成分的中草药可引起马兜铃酸肾病,其发病机理尚未完全明确。目前的研究表明肾小管上皮细胞是AA的主要作用靶点之一,AA可导致肾小管上皮细胞坏死、凋亡、活化或转分化。但AA是如何对细胞产生作用?是通过与受体结合的方式发挥作用,还是直接进入细胞发挥作用?如果进入细胞发挥作用的话,又是通过何种途径呢?我们利用体外细胞生物学实验对上述问题进行了研究。研究目的1)以人肾小管上皮细胞（HKC）为研究对象,观察AA是否能进入HKC细胞;2)观察AA通过何种途径进入HKC细胞;3)观察抑制AA进入细胞对其刺激CTGF表达作用的影响。研究方法1)采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术检测HKC细胞裂解液中AA。2)利用乳酸脱氢酶（LDH）释放实验,①检测有机阴离子转运蛋白（OATs）抑制剂丙磺舒和有机阳离子转运蛋白（OCTs）抑制剂四乙基铵对AA细胞毒性作用的影响;②构建pCMV5-HA-hOAT1/3表达质粒并进行转染,检测过量表达hOAT1/3对AA细胞毒性作用的影响。3)实时荧光定量聚合酶链反应和免疫印迹法检测OATs抑制剂丙磺舒对HKC细胞CTGF mRNA和蛋白表达的影响。研究结果1) AA-Na刺激组细胞破碎液中可检测到AA,对照组检测不到;依据峰面积粗略估算AA-Na刺激组细胞破碎液中AA浓度可达到1×10-3h/L。2) 60mg/L AA-Na可致HKC细胞LDH释放率显著升高,OATs抑制剂丙磺舒可抑制上述LDH释放（抑制率达27.5%,P＜0.05）,而OCTs抑制剂四乙基铵无此抑制作用。3) pCMV5-HA-hOAT1/3表达质粒转染HKC细胞后,AA对HKC的细胞毒性作用增强,且细胞毒性作用随转染质粒量的增大而增强。4) 40mg/L AA-Na能显著上调HKC细胞CTGF mRNA及蛋白表达,OATs抑制剂丙磺舒可抑制上述CTGF高表达（mRNA及蛋白表达抑制率分别为16%和21%,P＜0.05）。结论1) AA可以进入HKC细胞。2) AA可能通过hOAT1/3进入HKC细胞,AA细胞毒性作用与hOAT1/3表达水平相关。3) OATs抑制剂丙磺舒可抑制AA对HKC的细胞毒性作用,并可抑制AA诱导的HKC细胞CTGF高表达。
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