好氧反硝化细菌应用研究及nosZ基因克隆表达

论文摘要

反硝化是硝酸盐或亚硝酸盐被还原成N2O或N2的过程。细菌反硝化包括4个还原步骤,分别由硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、一氧化氮还原酶和一氧化二氮还原酶催化完成。传统理论认为,细菌的反硝化是一个严格的厌氧过程。然而,二十世纪80年代,Robertson等人对好氧反硝化细菌的发现以及随后人们对好氧反硝化机制的研究突破了传统认识,为废水处理工作者设计处理工艺提供了新的理论和思路,具有广泛的应用前景。研究表明,自然界蕴藏着丰富的好氧反硝化细菌,可在不同的环境（灌渠、水池、土壤以及活性污泥）中大量分离。现已发现许多菌属如产碱菌属（Alcaligenes）、副球菌属（Paracoccus）和假单胞菌属（Pseudomonas）都存在好氧反硝化现象。从湖北省洪湖市筛选分离出两株脱氮能力较强的菌株,分别命名为HS-N24、HS-N25。对这两株新筛选的细菌以及实验室原有可降解甲基对硫磷细菌HS-MP12、HS-MP13反硝化能力的进一步研究表明:在特定的培养基中,四株细菌均具有较强的反硝化能力,能分别在12-27h内将10mmol/L的硝酸盐完全去除。对两株筛选细菌的生理生化鉴定、分子水平的鉴定分析以及系统发育分析表明:细菌HS-N25属于Bacillus cereus（蜡状芽孢杆菌）,细菌HS-N24属于Pseudomonas putida（恶臭假单胞菌）。到目前为止,蜡状芽孢杆菌关于其降解硝酸盐、亚硝酸盐的特性还未见报道。对四株细菌降解含氮废水的研究,为高效、经济地处理含氮废水提供了切实可行的技术资源和理论基础,并为生物快速脱氮净化水处理提供了有用的菌源。四株细菌分别筛选于不同的自然环境,对四株细菌降解废水能力的应用研究,将有利于合理开发利用自然资源,保护自然生态环境。固定化微生物技术作为一种新的废水处理方法,已成为生物工程技术的一个重要分支。本文对反硝化菌的固定化工艺及去除废水中NH4-N的效果进行了探讨。本文将筛选的HS-N25（Bacillus cereus）经海藻酸钠固定后,检测其降解氨氮废水的能力。经过与未固定化的细菌降解能力比较,结果表明,经固定化后的微生物在低温状态（15℃）下降解废水能力较强,同时还可有效降解含酚的有毒废水。一氧化二氮（N2O）的排放是导致目前全球气候变暖和大气平流层臭氧损耗的主要因素。一氧化二氮给生态环境和人们身体健康带来严重危害,已引起各国科学家对它的重视。开展对一氧化二氮还原酶的研究,具有重要的实际意义。本文对反硝化细菌一氧化二氮还原酶的结构基因nosZ进行了克隆表达研究。以实验室保存种细菌P.stutzeri HS-03基因组DNA为模板,根据Genbank中的P.stutzeri nosZ基因序列（NO.M2262）设计引物进行PCR扩增,得到约1500bp的片段。将PCR产物经纯化后与克隆载体pMD18-T连接,构建重组质粒。经BamHI和HindⅢ酶切鉴定证实构建成功。将重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21中表达。经IPTG分别诱导后,重组质粒pET28-nosZ在约为21 KD处有较大的表达量。将重组质粒pMD-nosZ测序后得到目的片段的全序列,与Genbank中已知序列的施氏假单胞菌P.stutzeri一氧化二氮还原酶nosZ基因的序列同源性为90%。为深入研究一氧化二氮还原酶的结构与功能奠定了良好的基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 生物脱氮研究进展
• 1.1.1 细菌好氧反硝化作用机制
• 1.1.2 真菌反硝化作用机制
• 1.1.3 生物脱氮技术新进展
• 1.2 固定化微生物技术
• 1.2.1 固定化的概念
• 1.2.2 常用的固定化微生物载体
• 1.2.3 固定化细胞的制备方法
• 1.2.4 固定化细胞的应用
• 1.2.5 固定化细胞的展望
• 第二章 好氧反硝化细菌分离鉴定及在废水处理中的应用
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 包埋剂及溶液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 好氧反硝化细菌的筛选分离
• 2.2.2 好氧反硝化能力的检测
• 2.2.3 细菌基因组DNA的提取
• 2.2.4 16SrDNA基因的PCR扩增
• 2.2.5 16SrDNA的全序列测定和分析
• 2.2.6 形态结构观察及生理生化性质的测定
• 2.2.7 包埋小球的制作
• 2.2.8 低温下包埋及未包埋反硝化菌脱氮效果的比较试验
• 2.2.9 固定化小球处理含酚废水试验
• 2.3 结果及分析
• 2.3.1 好氧反硝化细菌的筛选分离和反硝化能力的研究
• 2.3.2 细菌降解含氮废水能力的研究
• 2.3.3 四株好氧反硝化细菌的鉴定
• 2.3.4 固定化小球废水脱氮结果
• 2.4 小结
• 2.5 讨论
• 第三章 一氧化二氮还原酶nosZ基因的克隆表达
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌株和质粒
• 3.1.2 化学试剂及抗菌素
• 3.1.3 常用贮存液
• 3.1.4 常用缓冲液
• 3.1.5 限制性内切酶及其它工具酶
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 目的基因的克隆以及重组表达质粒的构建策略（图3-1）
• 3.2.2 细菌基因组DNA的提取（参照2.2.3）
• 3.2.3 一氧化二氮还原酶nosZ基因的扩增
• 3.2.4 PCR产物回收和限制性内切酶消化后DNA片段的回收
• 3.2.5 质粒DNA的提取
• 3.2.6 DNA限制性内切酶消化
• 3.2.7 DNA片段的连接
• 3.2.8 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
• 3.2.9 蛋白质原核表达
• 3.2.10 表达产物的SDS-PAGE分析
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 一氧化二氮nosZ基因的获得
• 3.3.2 重组质粒pMD-nosZ的构建及鉴定
• 3.3.3 重组表达质粒pET-nosZ的构建及鉴定
• 3.3.4 nosZ基因在E.coli BL21中的表达与鉴定
• 3.3.5 nosZ基因序列的测定
• 3.4 小结
• 3.5 讨论
• 参考文献
• 硕士期间发表的论文
• 致谢