革皮氏海参（Pearsonothria graeffei）皂苷的制备与毒理学评价

论文摘要

海参皂苷(holothurian glycosides),又称海参素(holothurin),是从海参中提取的三萜皂苷类成分,具有抗真菌、抗病毒、细胞毒活性、抗肿瘤、溶血、免疫调节等广泛的生理学和药理学活性,但同时海参皂苷有较强的溶血性,导致海参皂苷应用的安全性存在很大隐患,限制了海参皂苷临床应用的进一步发展。本文以革皮氏海参(P. graeffei)为原料制备纯化海参总皂苷,分离纯化海参皂苷单体Holothurin A (HA)和Echinoside A (EA),并进行定量分析;对海参总皂苷的急性毒性、致突变性、对生殖细胞的遗传毒性以及30天毒性进行了系统的研究,对其安全性进行了综合评价。主要研究结果如下:海参总皂苷及海参皂苷单体HA和EA的制备。以革皮氏海参为原料,利用高效液相色谱仪对其纯度进行检测。通过乙醇粗提取法得到海参总皂苷,测得海参总皂苷的纯度为26%;利用大孔树脂柱层析法对海参总皂苷进行纯化,得到海参总皂苷的纯度为48%;利用正相硅胶柱层析法进行进一步纯化,得到海参总皂苷纯度为68%;经反相硅胶柱层析法分离得到海参皂苷单体HA和EA,纯度分别为82.6%和91.4%。;利用高效液相色谱法分离纯化两种单体后,纯度分别为92.3%和95.4%。采用灌胃法一次性给予小鼠不同剂量的海参皂苷,24h后观察小鼠死亡情况,根据Horn法,确定海参皂苷对小鼠的半数致死量为雌性为1.10g/kg,雄性为1.08g/kg;灌胃不同剂量海参皂苷14d后,海参皂苷各剂量组与正常对照组相比谷丙/谷草转氨酶、外周血象各指标没有显著变化,表明该剂量的海参皂苷对小鼠肝脏有无明显的损伤作用,对外周血成分无影响。海参皂苷无致突变作用。通过30小时受试法灌胃小鼠不同剂量的海参皂苷,小鼠处死后取骨髓细胞制片,统计各组小鼠骨髓细胞的微核率,结果显示海参皂苷各剂量组小鼠骨髓细胞与正常对照组均无显著性差异,表明海参皂苷的灌胃剂量在138~550mg/kg之间对机体无致突变的作用。海参皂苷无生殖细胞遗传毒性。连续5天灌胃不同剂量海参皂苷,35d后处死小鼠,制作小鼠精子涂片并进行观察,统计各组小鼠的精子畸形率,实验结果表明海参皂苷各剂量组的精子畸形率与正常对照组均无显著性差异,说明海参皂苷的灌胃剂量在138~550mg/kg之间对机体无生殖细胞遗传毒性。大鼠连续灌胃不同剂量海参皂苷(25 mg/kg、50 mg/kg和100 mg/kg)30天,结果表明长期服用海参皂苷不会对大鼠体重造成明显影响;海参皂苷对血液中的红细胞、血红蛋白、尿素氮、肌酐、尿酸、甘油三脂、总胆固醇以及低密度脂蛋白胆固醇的含量都无显著影响,对尿液中的尿素氮、肌酐、尿素等的含量也无显著影响;海参皂苷可以显著增加雄性大鼠白细胞与血小板的数量,说明海参皂苷可以增加白细胞与血小板的增殖能力;海参皂苷可以显著提高血清中高密度脂蛋白胆固醇的含量,说明海参皂苷可以促进脂质代谢,减缓脂肪积累;通过组织形态学检测发现,海参皂苷对肝脏、心脏、肾脏、肺、胃等组织无毒性作用,但会引起睾丸、卵巢的损伤。本文对海参总皂苷及海参皂苷单体HA和EA的分离提纯过程进行定量分析,为海参皂苷的规模化制备提供参考;同时,本文首次对海参皂苷的急性毒性进行了分析,系统的对海参皂苷的致突变性、生殖细胞遗传毒性以及亚慢毒性进行了研究,对海参皂苷的安全性进行了评价。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 海参研究进
• 1.1 海参的营养成分
• 1.2 海参的活性成分
• 1.2.1 胶原蛋白
• 1.2.2 多糖类物质
• 1.2.3 海参皂苷
• 1.2.4 脑苷脂
• 1.2.5 海参的其它化学成分
• 2 海参皂苷的研究进展
• 2.1 海参皂苷的理化性质
• 2.2 海参皂苷的提纯与测定
• 2.3 海参皂苷活性研究及应用
• 2.3.1 抑菌作用
• 2.3.2 抗肿瘤作用
• 2.3.3 溶血作用
• 2.3.4 免疫调节作用
• 2.4 皂苷安全性的研究现状
• 3 立题依据及研究的目的和意义
• 第一章 海参皂苷的制备与分离纯化
• 第一节 海参总皂苷的制备
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 革皮氏海参
• 1.1.2 试剂与材料
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 海参总皂苷的提取
• 1.2.2 大孔树脂柱层析法纯化海参总皂苷
• 1.2.3 正相硅胶柱层析法纯化海参总皂苷
• 2 结果
• 2.1 海参总皂苷的提取结果
• 2.2 大孔树脂层析法纯化海参总皂苷结果
• 2.3 正相硅胶层析法纯化海参皂苷结果
• 3 讨论
• 第二节 海参皂苷单体 Holothurin A （HA）和 Echinoside A （EA）的分离纯化
• 1. 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 海参总皂苷
• 1.1.2 试剂与材料
• 1.1.3 主要试剂配制
• 1.1.4 主要仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 反相硅胶柱层析法分离纯化海参皂苷单体
• 1.2.2 HPLC 法进一步纯化
• 2 结果
• 2.1 反相硅胶层析法分离结果
• 2.2 高效液相色谱仪纯化结果
• 3 结论
• 本章小结
• 第二章：海参皂苷的毒理学评价
• 第一节 革皮氏海参皂苷对小鼠的急性毒性实验的研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验动物
• 1.1.2 主要使用仪器
• 1.1.3 药品及试剂
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 海参总皂苷
• 1.2.2 预实验
• 1.2.3 正式实验
• 1.2.4 血清尿素氮、肌酐、谷草转氨酶和谷丙转氨酶含量测定
• 1.3 统计学分析
• 2 结果
• 2.1 半数致死量的确定
• 2.2 对小鼠血液生化指标的影响
• 2.3 对小鼠外周血象的影响
• 3 结论
• 第二节 海参皂苷对小鼠骨髓细胞微核的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验动物
• 1.1.2 主要仪器
• 1.1.3 药品及主要试剂配制
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 海参总皂苷的制备
• 1.2.2 动物分组和实验
• 1.2.3 小鼠骨髓细胞微核统计
• 1.3 统计学分析
• 2 结果
• 2.1 海参皂苷对小鼠骨髓细胞微核的影响
• 3 讨论
• 第三节 海参皂苷对小鼠精子畸形的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验动物
• 1.1.2 主要仪器
• 1.1.3 药品及主要试剂配制
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 海参总皂苷的制备
• 1.2.2 动物分组和实验
• 1.2.3 小鼠精子畸形统计
• 1.3 统计学分析
• 2 结果
• 2.1 精子畸形影响
• 3 讨论
• 第四节：海参皂苷的大鼠30 天喂养实验
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验动物
• 1.1.2 药品及试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 海参皂苷的制备
• 1.2.2 动物分组及实验
• 1.2.3 血液生化学指标的测定
• 1.2.4 对大鼠尿液中 BUN、Cr、UA 含量的测定
• 1.2.5 对大鼠尿液中BUN、Cr、UA 含量的测定
• 1.3 统计学分析
• 2 结果
• 2.1 一般状况观察
• 2.1.1 海参皂苷对大鼠体重的影响
• 2.1.2 海参皂苷对大鼠外周血象的影响
• 2.1.3 对大鼠血清中脂质含量的影响
• 2.1.4 对大鼠血清BUN、UA 和Cr 含量的影响
• 2.1.5 对大鼠血清中AST/ALT 含量的测定
• 2.1.6 对大鼠尿液中UA、BUN 和Cr 含量的影响
• 2.2 病理学检测
• 2.2.1 肝脏组织形态学观察
• 2.2.2 睾丸组织形态学观察
• 2.2.3 卵巢组织形态学观察
• 2.2.4 胃组织形态学观察
• 2.2.5 肾脏组织形态学观察
• 2.2.6 心脏组织形态学观察
• 2.2.7 肺组织形态学观察
• 3 讨论
• 4 小结
• 个人简历
• 本论文的特色及创新之处
• 致谢
• 论文发表情况
• 结论
• 参考文献