DNA聚合酶pol(?)及其新型剪接变异体的跨损伤复制功能的实验研究

论文摘要

研究背景与目的细胞基因组DNA随时遭受DNA损伤的侵袭,其中引起细胞内DNA损伤的因素主要包括内源性因素和外源性因素,其中内源性因素有:复制错误;随机碱基损伤（脱氨基作用、脱嘌呤作用）;代谢产物（氧自由基等因素引起的碱基氧化、甲基化、水解、错配等）。外源性因素有:化学性的（化学诱变剂碱基类似物5-BU、羟氨类（NH2OH）、亚硝酸盐（NO2）、烷化剂如氮芥类等）;物理性的（紫外线、γ射线等）。面对种类繁多、数目巨大的DNA损伤,细胞拥有完善的DNA损伤应答机制,细胞会启动各种损伤修复机制或凋亡途径,使细胞DNA损伤得到修复,或使无法修复的细胞选择凋亡。如果细胞的损伤修复机制或凋亡系统失常,即DNA损伤得不到正确修复或不能凋亡,细胞基因组DNA将大量积累突变,乃至染色体畸变,导致DNA高突变型细胞的产生,最终导致癌基因的激活,原癌基因的失活,细胞由高突变表型变成肿瘤表型。针对不同的损伤机制可采用不同的损伤修复机制,如随机碱基损伤可采用碱基切除修复、碱基甲基化可采用直接修复、紫外线导致的DNA损伤可采用核苷酸切除修复等。在众多的DNA损伤修复机制中,近年来在生物细胞中发现了一种由Y家族DNA聚合酶介导的跨损伤复制机制。Y家族DNA聚合酶对DNA损伤引起的空间结构的扭曲高度耐受,能以损伤的DNA为模板进行复制,以保证DNA复制的正常进行,帮助带有损伤DNA的细胞度过难关不致死亡。但是Y家族DNA聚合酶可不依据严格的碱基互补配对原则同时缺乏缺乏3′-5′核酸外切酶活性,因此没有错配碱基的校正阅读功能,所以复制DNA时有很高的碱基错配倾向[1-3],故又称为错配倾向聚合酶。Polι属于Y家族的DNA聚合酶之一,体外研究初步阐明了PolιDNA复制保真性很低,是目前发现的保真性最低的聚合酶,其保真性较高保真聚合酶低1000-10000倍;同时主要的生物学功能为实施某些DNA损伤后的跨损伤复制。但是其体内的生物学功能尚不清楚,本课题组以前的工作发现在乳腺癌细胞中Polι过度表达,并可能参与了乳腺癌细胞中基因组高突变型的形成。同时首次发现并成功克隆了Polι的同源异构体,由于该异构体比Polι少第5个外显子,故命名为Polιs5,但Polιs5的功能尚不得知。为了进一步研究Polι及Polιs5体内的生物学功能,以及跨损伤复制在遗传不稳定性产生中的作用,我们将构建稳定高表达Polι或Polιs5的HEK-293细胞系,采用紫外线（ UVC, 256nm）DNA损伤,利用激光共聚焦技术,通过对比Polι及Polιs5在UV损伤前后的细胞定位改变,观察Polι及Polιs5是否在DNA损伤后聚集到复制叉上,证实Polι及Polιs5参与体内DNA损伤后跨损伤复制过程;进一步,通过MTT法、体内突变检测系统,研究Polι及Polιs5介导的跨损伤复制的生物学功能。方法:1、HEK-293稳定高表达polι（polι-HEK-293）或polιs5（polιs5-HEK-293）细胞系的建立。pcDNA3.1-Polι和pcDNA3.1-Polιs5由本实验室保存。利用氯化钙法将两个质粒分别转化入DH5α大肠杆菌,经过质粒小抽,初步鉴定后,进行测序,将测序结果利用生物信息技术BLAT（www.genome.ucsc.edu）进行鉴定。以证明pcDNA3.1-Polιs5的目的片段Polιs5比pcDNA3.1-Polι的目的片段Polι少Polι的第5外显子,为我们进一步对Polι与Polιs5的功能对比研究奠定基础。HEK-293细胞经胰酶消化后,接种到35mm培养皿中,参照LipofectamineTM 2000脂质体操作说明,将lipofectamine2000-DNA复合物加入培养板中,37℃,5%CO2培养4小时后,换入含有血清的DMEM培养基,生长24小时后,传代致六孔板中,再培养48小时后,将培养基换为含有60Oug/ml G4l8的培养基进行稳定筛选。筛选出的抗G418的克隆经RT-PCR检测选出高表达目的基因的细胞克隆。2、Polι与Polιs5细胞定位研究。通过用激光共聚焦显微镜检测细胞在受到紫外线UVC照射后Polι及Polιs5在细胞核分布的改变分析其功能差异。培养HEK293细胞,利用阳离子脂质体瞬时转染的方法,将质粒pEGFP-C1、pEGFP-C1-Polι、pEGFP-C1-Polιs5分别转染HEK293细胞,36小时后,用紫外线UVC（15J/m2）照射使细胞DNA损伤,4小时后用激光共聚焦显微镜观察在质粒pEGFP-C1、pEGFP-C1-Polι、pEGFP-C1-Polιs5分别瞬时转染的HEK293细胞,细胞内绿色荧光蛋白在紫外线照射前后分布的改变。3、Polι与Polιs5对紫外损伤耐受的功能对比研究。HEK-293、Polι-HEK-293和Polιs5-HEK-293用胰酶消化后,按8000个/孔铺板于96孔板中,第二天细胞贴壁后,将培养基吸干,用不同剂量的紫外线照射细胞,加入培养基继续培养,24小时或72小时后用MTT法检测细胞生存率。4、polι与polιs5介导U V损伤后基因突变发生的对比研究。分别用1500 J/m2,3000J/m2的紫外剂量照射pSupFG1质粒后,将其分别转染入HEK-293、polι-HEK-293和polιs5-HEK-293细胞培养48小时后;提取细胞内的supF质粒,用DpnⅠ酶切三个小时,然后将其电转入SY204细菌;将细菌铺板在含有X-gal、IPTG和氨苄青霉素的平板上,长出蓝白斑,数蓝白斑数量计算突变频率;挑出白斑摇菌送往上海生工公司测序,统计突变频谱。结果:1、成功将质粒pcDNA3.1-Polι和pcDNA3.1-Polιs5转化DH5α大肠杆菌,并进行质粒小抽,初步鉴定后将质粒进行测序,将测序结果利用生物信息技术BLAT （www.genome.ucsc.edu）证明:pcDNA3.1-Polιs5的目的片段Polιs5比pcDNA3.1-Polι的目的片段Polι少Polι的第5外显子,为我们进一步对Polι与Polιs5的功能对比研究奠定了基础。我们通过脂质体转染法成功将我们的质粒转入HEK-293细胞,通过G418筛选,最终获得抗G418抗性的细胞克隆。通过Tripure分离提取细胞总RNA,电泳结果显示:18S和28S条带显示清晰,28S条带的强度约为18S条带的2倍,5S条带极弱,未见DNA污染条带出现,表明所提取的RNA完整性好,纯度可靠,可以满足RT-PCR实验的要求。通过RT-PCR初步检测结果表明:在具有G418抗性的HEK-293细胞中,检测到Polι、Polιs5表达量增加的细胞克隆,其表达量高于未转染HEK-293细胞。2、通过质粒pEGFP-C1、pEGFP-C1-Polι、pEGFP-C1-Polιs5瞬时转染HEK293细胞48小时后,激光共聚焦检测,结果显示质粒转染率高,在正常条件下,对照EGFP蛋白均匀分布于细胞浆与细胞核内, Polι及Polιs5则大多均匀分布于细胞核,为核蛋白。在UV （15J/m2）照射4小时后,对照EGFP蛋白仍均匀分布于细胞浆与细胞核内;Polι及Polιs5则均出现细胞核内局部荧光聚集现象,形成复制镜像,证实Polιs5与Polι参与紫外线UVC导致的DNA损伤的跨损伤复制过程。3、用不同剂量的紫外线照射细胞后24小时,用MTT法测细胞存活率。HEK-293细胞存活率由100%下降到72%;稳定高表达Polι-HEK-293细胞存活率由100%下降到76%;稳定高表达Polιs5的Polιs5-HEK-293细胞存活率由100%下降到82%;经过统计学分析三者之间没有明显差异。用不同剂量的紫外线照射细胞后72小时,用MTT法测细胞存活率。HEK-293细胞存活率由100%下降到16%; Polι-HEK-293细胞存活率由100%下降到12%;Polιs5-HEK-293细胞存活率由100%下降到14%;经过统计学分析三者之间没有明显差异。4、我们将pSupFG1质粒成功转入HEK-293、polι-HEK-293、polιs5-HEK-293,并提取出细胞内PsupFG1质粒,然后高效的将其转入SY204细菌,最后铺板数出蓝白斑得出突变频率,通过挑白斑摇菌测序得出突变频谱。结果显示polι或polιs5在细胞内的过度表达将导致DNA损伤后诱发高突变的产生,并具有一定的突变特征。。结论:1.成功构建了稳定polι或polιs5高表达的细胞模型,为进一步研究polι和polιs5的体内生物学功能奠定基础。2.证实polι和polιs5能参与细胞紫外损伤后的细胞应答过程。3. polι和polιs5对紫外线损伤后的细胞的生存没有影响。4. polι和polιs5参与介导体内紫外线DNA损伤诱发高突变的产生,并具有一定的突变特征。5. polιS5作为polι的剪切异构体与polι具有相似的功能。

论文目录

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• 英文摘要
• 中文摘要
• 论文正文 DNA 聚合酶polι及其新型剪接变异体的跨损伤复制功能的实验研究
• 前言
• 第一部分 HEK-293 稳定高表达polι或polιs5 细胞系的建立
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第二部分 Polι与Polι55 细胞定位研究
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第三部分 polι与polι55 对紫外损伤耐受的对比研究
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第四部分 polι与polι55 介导U V 损伤后基因突变发生的对比研究
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 全文结论
• 致谢
• 照片
• 参考文献
• 文献综述 DNA 聚合酶Polι的研究进展
• 参考文献
• 攻读硕士研究生期间撰写的论文