Hsc70蛋白：抗HBV耐药的理论与实践

论文摘要

乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus,HBV）感染可引起急性和慢性乙型肝炎,是导致肝硬化、肝癌等严重肝脏疾患的最主要原因之一。治疗慢性乙肝的关键是抑制HBV DNA的复制,以减少肝脏并发症的出现。过去十几年,核苷类似物的出现使乙肝的治疗有了重要的进展,然而长期用药引起耐药性病毒变异株的出现限制了它们的临床效果。因此,发现新机制的抗乙肝药物一直是我国药物研究的重点之一。美国FDA（食品药品管理局,Food and Drug Admistraton）批准的抗HBV核苷类药物主要作用于HBV DNA聚合酶,长期应用诱导其发生耐药性突变。而病毒的复制过程需宿主细胞蛋白的帮助,因此寻找病毒所必需,而宿主细胞生存非必需的蛋白有可能成为发现抗HBV药物的新靶点。以往研究表明分子伴侣热休克蛋白Heat shock cognate 70（Hsc70,HspA8）可能是HBV复制的一个重要辅助蛋白,我们认为该蛋白有可能成为HBV多聚酶之外的一个抗HBV的新药物靶点。为了证明这个结果,我们设计了以下实验。将外源性Hsc70导入稳定表达HBV的2215细胞,使Hsc70基因高表达,结果使细胞内HBV复制增加了1.8倍;将特异性Hsc70 siRNA转染2215细胞,HBV复制显著降低,并且没有细胞毒性。以上结果表明,宿主Hsc70是HBV复制所必需的一个蛋白,而对宿主细胞的生长并不是必需的因素。通过筛选,我们首次发现我国天然化合物苦参素（Oxymatrine,OMTR;MW:264.31）能特异性下调肝细胞Hsc70的表达,在体内外均具有明确的抗HBV疗效,并且不影响HBV多聚酶的活性,也基本没有细胞毒性。OMTR是从中药苦豆子和苦参等中药中提取出来的一种生物碱,是具有明确化学结构的天然化合物,有多种药理作用。OMTR在我国已经有十几年的临床应用历史,主要用于抗肝炎的治疗,其疗效和安全性均得到普遍认可,但作用机理一直不清楚。上述研究为阐明OMTR的分子机理提供了重要的线索。我们进一步的研究表明,OMTR能使细胞中Hsc70 mRNA的降解速度明显加快,使其半衰期(T1/2)缩短一半以上,说明OMTR主要在转录后水平通过降低Hsc70 mRNA的稳定性来下调其表达。OMTR降低Hsc70 mRNA稳定性的机制与mRNA的3’UTR结构有关。我们将Hsc70 5’UTR及3’UTR全长分别插入到pLuc中Luc报告基因的上下游的5’端和3’端形成重组质粒,将这些质粒瞬时转染肝细胞后用OMTR处理,再分析含有Hsc70 3’UTR或5’UTR的肝细胞内Luc mRNA的水平。结果显示插入3’UTR后细胞内Luc mRNA的基础表达水平明显下降,而5’UTR则对Luc mRNA无影响。这说明Hsc70 mRNA3’UTR是OMTR的反应元件。OMTR可以有效地抑制临床野生株和变异株HBV DNA复制中间体的形成,从而抑制HBV复制,而对HBV RNA没有影响,由此我们得出了OMTR抗HBV的分子机理全图。由于OMTR通过作用于宿主降低Hsc70的表达水平来抑制HBV复制,我们推测这种作用机制的药物不易引起HBV耐药。我们分别用OMTR,3TC（Lamivudine,拉米夫定）及OMTR和3TC的联合同时作用于2215细胞,连续处理细胞8个月。结果显示,OMTR持续抑制HBV DNA的水平,3TC单独给药在第3个月出现病毒反跳,而OMTR和3TC联合给药不仅使细胞中HBV DNA持续降低而且还防止了HBV耐药的发生。与HIV治疗药物相比,尤其在联合化疗方面,对于HBV并没有一种理想的联合治疗方案,主要原因是由于核苷类似物抗HBV作用靶点的单一性。鉴于OMTR通过与核苷类似物不同的机理来抑制HBV复制,我们探索了OMTR、PFA（Foscarnet sodium,磷甲酸钠）与ADV（Adefovir Dipivoxil,阿德福韦酯）联合进行抗HBV治疗的可能性。我们用OMTR、PFA和ADV矩阵组合,处理2215细胞,7天后,结果显示,与单独给药相比,剂量比例适当的联合给药处理的细胞中HBV DNA总量减少更为显著,明显优于OMTR、PFA和ADV单独给药,为今后联合化疗提供了基础。对于慢性乙型肝炎（CHB）患者的临床研究表明,OMTR 0.4g每天2次口服给药治疗12个月后,能使17例对3TC耐药的CHB患者血清HBV DNA和HBeAg浓度分别下降96%和70%,效果与20例初次治疗的CHB患者相当。所有患者在用OMTR治疗后未出现明显不良反应。反映肝功能指标的ALT、AST、γ-GT,与用药前相比,显著降低（ALT,AST,γ-GT:p＜0.001）,表明CHB患者肝功能明显改善。临床肝组织活检的结果表明,OMTR在抑制肝脏组织HBV载量的同时也显著降低了组织中Hsc70的表达水平,进一步在人体证实了OMTR通过宿主Hsc70抑制HBV复制的机制。在进一步的研究中,我们发现对于CHB患者,单用3TC治疗12个月,发生耐药的几率为7/25;而用OMTR与3TC联合治疗12个月后发生耐药的几率仅为1/15（3TC vs 3TC/OMTR,p＜0.01）。我们的该项研究包括了从分子水平到细胞水平,到临床试验等一系列工作。结果表明,细胞蛋白Hsc70在HBV复制中起重要作用,是一个新的抗HBV靶点;OMTR是一种安全可靠的具有新型机制的抗乙肝病毒的药物,其作用机制与核苷类似物完全不同,它通过降低宿主Hsc70表达来抑制病毒复制;OMTR抗HBV的特点表现为不会对病毒产生化疗压力,因此可以避免诱导耐药变异的发生。我们认为OMTR可单独或与核苷类似物联合应用于临床,治疗慢性乙肝患者,以解决HBV的耐药问题。

论文目录

• 目录
• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 前言
• 实验材料
• 1. 细胞系
• 2. 药物
• 3. 主要生化试剂
• 4. 抗体
• 5. 质粒和细菌菌株
• 6. 分子生物学试剂盒
• 7. 引物和探针
• 8. 临床试验病例
• 9. 主要仪器
• 实验方法
• 1. Hsc70 siRNA转染对肝细胞生长状态及对病毒表达的影响
• 1.1 siRNA的设计合成
• 1.2 RNA干扰对细胞生长状态的研究
• 1.3 siRNA的转染
• 1.4 real-time PCR分析
• 2. 肝细胞内Hsc70基因高水平表达对病毒复制的影响
• 2.1 基本分子生物学实验方法
• 2.2 重组质粒的构建及表达
• 2.3 瞬时转染
• 2.4 质粒转染
• 3. OMTR作用对肝癌细胞生长状态的研究
• 3.1 流式细胞仪分析细胞周期变化
• 50'>3.2 MTT测定药物TC₅₀
• 3.3 生长曲线的绘制
• 4. OMTR作用细胞后HBV DNA及Hsc70基因表达水平的检测
• 4.1 OMTR作用细胞后HBV DNA及Hsc70基因表达水平的检测
• 4.2 用TRIzol试剂提取RNA的方法
• 4.3 细胞内Hsc70蛋白的检测
• 4.4 OMTR下调肝细胞Hsc70基因表达的特异性研究
• 5. OMTR影响Hsc70 mRNA稳定性的机理研究
• 5.1 重组质粒的构建及表达
• 1/2的测定'>5.2 Hsc70 mRNA T_1/2的测定
• 6. OMTR体外抗HBV活性的研究
• 6.1 逆转录反应
• 6.2 病毒mRNA水平的检测
• 6.3 病毒复制中间体的检测
• 7. OMTR体外耐药性研究
• 7.1 OMTR长期作用2215细胞对病毒复制的影响
• 7.2 OMTR对耐药细胞病毒复制中间体的影响
• 8. OMTR、PFA与ADV联合用药对2215细胞中HBV复制的影响
• 8.1 PFA、ADV和OMTR联合用药处理2215细胞
• 8.2 细胞DNA的提取
• 8.3 Dot Blot分析法
• 9. 临床试验
• 9.1 OMTR作用于3TC耐药患者疗效观察
• 9.2 肝脏活检
• 9.3 耐药研究
• 10. 统计分析
• 结果与讨论
• 1. 宿主细胞Hsc70是HBV复制的辅助因子
• 2. OMTR抑制HBV复制的机理研究
• 3. OMTR通过降低Hsc70 mRNA的稳定性来下调其表达
• 4. OMTR在Hsc70 mNRA上的反应元件位于3’UTR
• 5. OMTR体外抗病毒的研究
• 6. OMTR体外抗HBV耐药性研究
• 7. OMTR能有效抑制慢性乙型肝炎患者及耐药慢性乙型肝炎患者的HBV复制
• 结论
• 参考文献
• 文献综述:热休克蛋白70的结构和功能
• 参考文献
• 博士学习期间发表的文章
• 参加的学术会议
• 致谢