阿维链霉菌孢子色素生物合成及PhoR-PhoP双组分信号系统对阿维菌素产量的影响

论文摘要

阿维菌素（avermectins）是由阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis）NRRL8165产生的一组具有相似结构的十六元大环内酯类抗生素,该抗生素驱虫活性极强,且抗寄生虫机制独特,与其它抗寄生虫药无交叉耐药性,在农业和畜牧业中得到广泛的应用。阿维链霉菌除了产阿维菌素,还可产生多种其他的次级代谢产物,如孢子色素、黑色素和寡霉素等。其中孢子色素属于芳香族聚酮类化合物,从聚酮途径分析来看,阿维菌素和孢子色素聚酮化合物的合成过程都需要乙酰辅酶A的参与。推测孢子色素与阿维菌素生物合成之间可能有竞争底物的现象。本文以野生型阿维链霉菌NRRL8165为出发菌株,用PCR方法克隆孢子色素基因簇直系同源基因（whiEα）侧翼片段,并构建基因置换载体pHL643。将pHL643跨属接合转移进入阿维链霉菌NRRL8165,通过同源重组,对染色体上的whiEα基因簇进行置换,得到3株阿泊拉霉素抗性、硫链丝菌素敏感的重组菌株（ZJ1-1,ZJ1-2和ZJ1-3）,均表现为孢子色素合成缺陷。经摇瓶发酵和HPLC检测,发现whiEα基因簇置换菌株所产阿维菌素产量明显提高,表明孢子色素与阿维菌素生物合成之间是有一定的相互影响。许多不同种类的抗生素及其它次级代谢物的生物合成都受磷酸盐调节。只有在磷酸盐限制性培养条件下,一些有价值的组分才能产生。近年研究证明,在变铅青链霉菌（Streptomyces lividans）中对环境中磷酸盐代谢的调节是由PhoR-PhoP双组分信号传导系统介导的,将其中断后,放线紫红素和十一烷灵菌红素超量表达。本文通过分析阿维链霉菌的基因序列,发现同样也存在着与phoR-phoP高度同源的基因。为了研究其功能,本文构建基因置换载体pHL645,将其跨属接合转移进入阿维链霉菌NRRL8165,筛选得到phoR-phoP基因置换菌株ZJ2。ZJ2在不加磷酸盐的YMS培养基上,菌体生长状态不良,但在加入一定量磷酸盐的YMS培养基上,菌体生长良好且菌落颜色加深。经摇瓶发酵和HPLC分析,发现ZJ2菌株只有在加入一定量的磷酸盐条件下发酵,才能合成阿维菌素,但产量相比野生型很低。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语
• 1 文献综述
• 1.1 链霉菌及其研究简介
• 1.2 阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis）简介
• 1.2.1 阿维菌素生物合成基因簇
• 1.2.2 阿维菌素生物合成
• 1.2.3 白基因（whi）
• 1.2.4 灰黑色孢子色素合成基因簇
• 1.3 聚酮化合物
• 1.4 阿维菌素高产菌株育种和代谢工程的研究
• 1.4.1 构建高产菌株
• 1.4.2 提高特定组分的产率
• 1.4.2.1 消除A组分
• 1.4.2.2 消除b组分
• 1.4.2.3 消除寡霉素组分
• 1.4.3 添加前体物质增加阿维菌素的产量
• 1.5 链霉菌双组分调控机制
• 1.6 本课题研究的立论依据、目的、意义
• 2 材料与方法
• 2.1 菌株
• 2.2 质粒与引物
• 2.3 培养基与生化试剂
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 链霉菌培养及菌种保藏
• 2.4.2 大肠杆菌质粒DNA的小量提取
• 2.4.3 大肠杆菌质粒DNA的少量快速提取及检测
• 2.4.4 链霉菌总DNA的提取
• 2.4.5 氯化锂纯化DNA
• 2.4.6 酶连反应
• 2.4.7 大肠杆菌和链霉菌的两亲本属间接合转移
• 2法）及转化'>2.4.8 大肠杆菌感受态细胞的制备（CaCl₂法）及转化
• 2.4.9 DNA片段凝胶回收（试剂盒回收）
• 2.4.10 AT克隆
• 2.4.11 PCR及相关技术
• 2.4.12 Southern杂交
• 2.4.13 阿维菌素的HPLC测定
• 3 结果与分析
• a基因簇的基因置换'>3.1 whiE_a基因簇的基因置换
• 3.1.1 基因置换和基因中断的原理
• a基因簇置换载体的构建'>3.1.2 whiE_a基因簇置换载体的构建
• a基因簇的基因置换'>3.1.3 染色体上whiE_a基因簇的基因置换
• 3.1.4 置换菌株发酵产物的HPLC分析
• 3.2 PhoR-PhoP双组分信号系统对阿维链霉菌的形态分化及阿维菌素生物合成的影响
• 3.2.1 PhoR-PhoP的序列分析
• 3.2.2 阿维链霉菌phoR-phoP基因置换载体的构建
• 3.2.3 阿维链霉菌phoR-phoP基因置换菌株筛选及其基因型验证
• 3.2.4 phoR-phoP基因置换菌株的表型观察
• 3.2.4 phoR-phoP基因置换菌株的遗传互补
• 3.2.5 phoR-phoP基因置换菌株发酵产物的HPLC分析
• 4 总结与讨论
• 4.1 总结
• 4.2 讨论
• 4.3 展望
• 参考文献
• 致谢