球孢白僵菌基因工程菌株构建及杀虫效率评价

论文摘要

随着社会经济的发展和人们环保意识的提高,环境友好型生物源杀虫剂的应用受到越来越高的重视。利用昆虫病原真菌加工而成的真菌杀虫剂的应用及基础研究得到了长足的发展,但由于存在击倒昆虫时间较长、对环境条件要求高等缺点,真菌杀虫剂的广泛应用受到限制。因此利用基因工程和细胞工程等技术提高菌株毒力,遗传改造获得适合市场需要的真菌杀虫剂具有重要的应用价值。球孢白僵菌（Beauveriabassiana）作为重要的昆虫病原真菌在害虫的生物防治中发挥着重要作用。本文以球孢白僵菌作为出发菌株,同时引入双价毒力基因,即降解昆虫体壁的类枯草杆菌蛋白酶基因Pr1A和北非蝎（Androctonus australis）昆虫特异性神经毒素多肽基因AaIT,构建了高毒力双价工程菌株。为了获得双价工程菌株,本实验首先构建了含有不同筛选标记和目的基因的载体pGPS3Ben-Pr1A和pGPET1。并且通过对分生孢子的抑制性实验,筛选出两种抗性药对球孢白僵菌的最佳抑制浓度,其中草胺磷对球孢白僵菌的最佳抑制浓度为100μg/ml,苯菌灵对球孢白僵菌的最佳抑制浓度为2μg/ml。本实验选用了两种不同的遗传转化方法对球孢白僵菌进行遗传改造,获得了一价工程菌株Bb13T和Bb202T,及二价工程菌株Bb13Tpr1A。RT-PCR和Western blot结果证明,Pr1A和AaIT均在重组菌株中组成性转录和表达。PR1A蛋白酶活性测定结果表明,超表达PR1A的二价工程菌株的酶活相对于野生型菌株得到了极大的提高。并且通过初步的注射虫体实验,筛选出毒力相对较高的一价工程菌株Bb13T-4-1、Bb13T-10-3和Bb202T-7,和二价工程菌株Bb13TPr1A-1、Bb13TPr1A-2和Bb13TPr1A-3。对松墨天牛（Monochamus alternatus）的生物测定结果表明,超量表达AAIT的一价工程菌株Bb202T-7提高了杀虫效率约11.1%。使用大蜡螟（Galleria mellonella）和马尾松毛虫（Dendrolimus punctatus）进行生物测定的结果同样显示,超量表达AaIT单价基因及AaIT和pr1A双价基因均能显著地提高重组菌株的毒力。用大蜡螟做生测试虫,在孢子浓度为1×107个/ml时,与野生型菌株Bb13相比,超量表达AaIT的重组菌株Bb13T的致死中时(LT50)平均缩短了24.4%,同时超量表达AaIT和pr1A双价基因的Bb13TPr1A的LT50平均缩短了20.9%。马尾松毛虫的生物测定中,在孢子浓度为1×107个/ml时,与野生型菌株Bb13相比,超量表达AaIT基因的重组菌株Bb13T的LT50平均缩短了40%,其致死中浓度(LC50)降低了约15倍的剂量;超量表达AaIT和Pr1A双价基因的Bb13Tpr1A的LT50平均缩短了36.7%,同时Bb13TPr1A的LC50也降低了约8倍剂量。蛋白酶抑制实验及Western blot结果证明PR1A对AAIT有降解作用。并且生物测定结果表明,二价菌株的杀虫效率低于一价菌株的杀虫效率,更充分证明了PR1A对AAIT具有降解作用。因此在以后构建多价工程菌株时,首先要充分分析蛋白之间的相互作用以选出最佳的基因组合。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 昆虫病原真菌的侵染过程及相应分子对策
• 1.1.1 体表附着阶段
• 1.1.2 体壁穿透阶段
• 1.1.2.1 附着胞的形成
• 1.1.2.2 分解寄主外壳的水解酶
• 1.1.2.2.1 蛋白质降解酶
• 1.1.2.2.2 几丁质酶
• 1.1.3 体内定殖阶段
• 1.1.3.1 免疫抵抗反应
• 1.1.3.2 分泌毒素
• 1.1.3.3 体内生长
• 1.2 昆虫病原真菌的遗传转化方法
• 1.2.1 PEG/原生质体转化法
• 1.2.2 醋酸锂转化法
• 1.2.3 电击转化法
• 1.2.4 基因枪转化法
• 1.2.5 农杆菌介导转化法
• 1.3 昆虫病原真菌的研究应用前景
• 1.3.1 虫生真菌毒力基因工程的研究
• 1.3.2 虫生真菌制剂的研究
• 1.4 总结与展望
• 2 引言
• 2.1 研究的目的意义
• 2.2 研究内容
• 2.3 研究内容的创新之处
• 3 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 质粒载体
• 3.1.3 主要的培养基
• 3.1.4 主要的化学试剂
• 3.1.5 常用的缓冲液和贮藏液
• 3.1.6 主要的仪器设备
• 3.2 方法
• 3.2.1 pGPS3Ben-Pr1A载体的构建
• 3.2.1.1 引物设计
• 3.2.1.2 质粒抽提
• 3.2.1.3 目标片段扩增
• 3.2.1.4 酶切及纯化
• 3.2.1.5 去磷酸化与连接
• 3.2.1.6 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 3.2.1.7 转化大肠杆菌
• 3.2.1.8 菌落PCR验证
• 3.2.1.9 酶切验证
• 3.2.2 球孢白僵菌对草胺磷的敏感性测定
• 3.2.3 球孢白僵菌对苯菌灵的敏感性测定
• 3.2.4 芽生孢子法转化Bb13
• 3.2.4.1 芽生孢子的制备
• 3.2.4.2 芽生孢子的转化
• 3.2.5 原生质体法转化Bb202
• 3.2.6 球孢白僵菌基因组DNA的提取
• 3.2.7 真菌转化子的PCR初步筛选与验证
• 3.2.8 真菌转化子的继代培养
• 3.2.9 真菌转化子的RT-PCR验证
• 3.2.9.1 真菌基因组RNA的提取与检测
• 3.2.9.2 cDNA第一链的合成
• 3.2.9.3 以cDNA为模板的PCR验证
• 3.2.10 PR1A的酶活测定
• 3.2.11 Western blot检测
• 3.2.11.1 蛋白样品制备
• 3.2.11.2 SDS-PAGE
• 3.2.11.3 Western blot
• 3.2.12 生物测定
• 3.2.12.1 菌种与菌剂
• 3.2.12.2 供试昆虫
• 3.2.12.3 处理方法
• 3.2.12.4 毒力测定的数据处理
• 3.2.13 PR1A对AAIT降解的定性分析
• 4 结果与分析
• 4.1 pGPS3Ben-Pr1A载体的验证
• 4.1.1 目标片段扩增结果
• 4.1.2 菌液PCR验证
• 4.1.3 酶切验证
• 4.2 球孢白僵菌抗药性的测定
• 4.2.1 球孢白僵菌对草胺磷的敏感性测定结果
• 4.2.2 球孢白僵菌对苯菌灵的敏感性测定结果
• 4.3 一价工程菌株的筛选及验证
• 4.3.1 一价工程菌株Bb202T第一代转化子的检测与验证
• 4.3.2 一价工程菌株Bb202T-7继代培养五代后PCR验证
• 4.3.3 一价工程菌株Bb13T第一代转化子的验证及初步毒力测定
• 4.3.4 一价工程菌株Bb13T继代培养五代后PCR验证及初步毒力测定
• 4.4 二价工程菌株的筛选及验证
• 4.4.1 二价工程菌株Bb13TPr1A第一代转化子的验证
• 4.4.2 二价工程菌株Bb13TPr1A继代培养五代后PCR验证
• 4.4.3 二价工程菌株的PR1A酶活测定
• 4.5 工程菌株的RT-PCR验证
• 4.6 工程菌株的Western blot检测
• 4.6.1 AAIT的Western blot检测
• 4.6.2 PR1A的Western blot检测
• 4.7 毒力的生物测定
• 4.7.1 致死中时间的生物测定
• 4.7.2 致死中浓度的生物测定
• 4.8 PR1A对AAIT的降解作用
• 4.8.1 定性检测PR1A对AAIT的降解作用
• 4.8.2 Western blot检测PR1A对AAIT的降解作用
• 5 讨论
• 5.1 关于质粒载体构建
• 5.2 遗传转化方法的研究
• 5.3 二价工程菌株的构建
• 5.4 PR1A对AAIT的降解作用
• 5.5 基因工程重组菌株的安全性问题及解决方案
• 6 小结
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 在读期间投稿和发表的学术论文
• 附图