SARS病毒RdRp基因的RNA干扰研究

论文摘要

严重急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）是1种传染性强、病死率高的疾病，目前尚无公认的有效治疗方法。其病原体已被确认为冠状病毒的1个变种，称为SARS冠状病毒。RNAi（RNA interference，RNAi）可以高效、特异地下调靶基因的表达，不仅是研究基因功能的有力工具，而且为特异性基因治疗提供了新的技术手段。能有效抑制靶基因表达的siRNA（small interfering RNA）正在被开发成新型特异性药物，用来治疗病毒感染性疾病、肿瘤以及遗传性疾病等。本研究的目的就是针对SARS病毒筛选出高效、特异的siRNA，为进一步的药物研发奠定基础。生物信息学分析结果表明，RNA依赖性的RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase，RdRp）基因是SARS病毒基因组中最保守的基因；在病毒的所有蛋白质中，RdRp是最重要的蛋白质，是病毒复制增殖所必需的酶。因此，本研究选择SARS病毒的RdRp基因为RNAi的靶基因。我们首先设计了1种安全、高效而可靠的方法来合成该基因：根据DNA shuffling技术的原理和SARS病毒RdRp基因的序列，设计并合成了多条寡核苷酸片段，每个片段末端都两两互补，从而在PCR过程中相互延伸，最终精确地组装成RdRp基因。所得基因的序列与预期设计完全吻合。利用pcDNA3.1（+）和pEGFP-C1载体构建了3类真核重组表达质粒，并以增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP）作为标记基因。构建的表达质粒包括：1)分别表达RdRp和EGFP基因的质粒：pcDNA-RdRp（pcDNA-R）和pcDNA-EGFP（pcDNA-G）。转染Vero E6细胞后，pcDNA-G可表达明显的绿色荧光蛋白；2)表达RdRp和EGFP融合基因的质粒：pcDNA-GR和pcDNA-RG，pEGFP-CR1和pEGFP-CR2。转染Vero E6细胞后，前2个质粒表达的蛋白质荧光

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第一章 SARS病毒RdRp基因的组装及其表达质粒的构建

摘要

1 引言

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 合成的寡核苷酸片段

2.1.2 主要试剂

2.1.3 质粒载体

2.1.4 大肠杆菌菌种

2.1.5 大肠杆菌培养基

2.2 方法

2.2.1 SARS病毒RdRp基因的组装

2.2.2 RdRp基因真核表达质粒的构建

2.2.3 RdRp基因的序列分析

3 结果

3.1 SARS病毒RdRp基因的组装

3.2 pcDNA-RdRp表达质粒的构建

3.3 SARS病毒RdRp基因的序列分析

4 讨论

4.1 SARS病毒基因组的生物信息学分析

4.1.1 SARS病毒系统进化分析

4.1.2 SARS病毒核苷酸序列分析

4.1.3 SARS病毒蛋白质功能分析

4.2 组装RdRp基因的其他几套技术方案

4.3 本项技术的几个关键问题

4.4 组装PCR技术的拓展应用

小结

参考文献

第二章 SARS病毒RdRp基因与EGFP基因表达质粒的构建和鉴定

摘要

1 引言

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 合成的引物

2.1.2 主要试剂

2.1.3 质粒载体

2.1.4 细胞株

2.1.5 细胞培养液

2.1.6 大肠杆菌菌株

2.1.7 大肠杆菌培养基

2.1.8 仪器设备

2.2 方法

2.2.1 通用的基因克隆程序

2.2.2 Vero E6细胞的培养

2.2.3 Vero E6细胞的脂质体转染

2.2.4 Vero E6细胞的电穿孔法转化

2.2.5 Vero E6细胞中表达EGFP的观察

2.2.6 RNA的提取

2.2.7 RT-PCR分析

2.2.8 RNA专用试剂和耗材的处理

3 结果

3.1 表达质粒的构建

3.1.1 总体设计方案

3.1.2 表达质粒的构建

3.2 重组质粒的鉴定

3.2.1 重组质粒的酶切和PCR鉴定

3.2.2 重组质粒的序列鉴定

3.3 重组表达质粒的功能研究

3.3.1 靶基因在Vero E6细胞中的转录

3.3.2 重组质粒表达蛋白质的荧光显微镜分析

4 讨论

4.1 RNAi研究中报告基因的选择

4.1.1 常用的报告基因

4.1.2 绿色荧光蛋白

4.2 RNAi研究中载体的选择

小结

参考文献

第三章稳定表达SARS病毒Rdgp基因的细胞株的建立

1 引言

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 真核表达质粒

2.1.2 细胞株

2.1.3 细胞培养液

2.1.4 细胞培养常用溶液

2.1.5 大肠杆菌菌种

2.1.6 大肠杆菌培养基

2.1.7 主要试剂

2.2 方法

2.2.1 细胞冻存

2.2.2 细胞复苏

2.2.3 细胞培养

2.2.4 细胞的转染

2.2.5 细胞的电转化

2.2.6 细胞转染效率的测定

2.2.7 单克隆细胞株的建立

2.2.8 哺乳动物细胞染色体的制备

2.2.9 质粒的制备

2.2.10 质粒的线性化处理

3 结果

3.1 细胞转染条件的优化

3.1.1 DNA和SF加量及其相互比例对转染效率的影响

3.1.2 转染时细胞密度对转染效率的影响

3.1.3 DNA-SF复合物与细胞共同孵育的时间对转染效率的影响

3.1.4 不同方法制备的DNA对转染效率的影响

3.2 不同细胞株对G418敏感性的检测

3.3 单克隆细胞株的建立

3.4 单克隆细胞株的鉴定

4 讨论

4.1 影响细胞转染效率的因素

4.1.1 细胞的种类

4.1.2 细胞的生长状态

4.1.3 DNA和转染试剂的比例和加量

4.1.4 DNA-转染试剂复合体与细胞共孵育的时间

4.1.5 血清和抗生素的添加

4.2 细胞株建立过程中的注意事项

小结

参考文献

第四章 SARS病毒RdRp基因的RNA干扰

摘要

1 引言

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 siRNA的模板DNA序列和PCR引物

2.1.2 主要试剂

2.1.3 质粒

2.1.4 细胞株

2.1.5 细胞培养液

2.1.6 常用溶液

2.1.7 实验动物

2.1.8 主要仪器设备

2.2 实验方法

2.2.1 siRNA的体外转录合成

2.2.2 siRNA的Cy3标记

2.2.3 siRNA表达盒的构建

2.2.4 细胞的培养、复苏、冻存

2.2.5 细胞的转染

2.2.6 细胞中EGFP和Cy3-siRNA的观察

2.2.7 转染效率和RNAi效果的荧光显微镜法测定

2.2.8 Real-time quantitative RT-PCR

2.2.9 流式细胞仪分析RNAi结果

2.2.10 小鼠体内的RNA干扰实验

3 结果

3.1 siRNA的体外RNAi实验

3.1.1 siRNA的体外转录合成

3.1.2 siRNA的Cy3标记

3.1.3 siRNA的转染效率

3.1.4 Vero E6细胞中RNAi效果的荧光显微镜法检测

3.1.5 Vero E6细胞中RNAi效果的定量PCR检测

3.1.6 Vero E6细胞中RNAi效果的流式细胞仪检测

3.1.7 3种检测方法得到的RNAi效果的比较

3.1.8 siRNA对内源基因表达的抑制作用

3.2 SEC的体外RNAi实验

3.2.1 SEC的构建

3.2.2 SEC在细胞中的RNAi作用

3.3 siRNA的小鼠体内RNA干扰

4 讨论

4.1 应用荧光显微镜计数法判断RNAi效果时的注意事项

4.1.1 显微镜对观察结果的影响

4.1.2 标记分子的荧光强度

4.1.3 其他

4.2 获得siRNA的方法

4.2.1 体外转录法合成siRNA

4.2.2 siRNA表达框

4.2.3 化学合成

4.2.4 “鸡尾酒”法

4.2.5 siRNA表达载体

4.3 体内RNAi研究涉及的靶基因

4.4 体内RNAi研究的基因导入途径

4.4.1 尾静脉注射

4.4.2 病毒感染体细胞

4.4.3 移植

4.4.4 通过转基因技术制备RNAi转基因动物

4.4.5 其他

4.5 基因导入的载体系统

4.5.1 病毒载体系统

4.5.2 非病毒载体系统

4.6 RNAi效果的判断方法

4.7 抑制SARS病毒RdRp基因表达的siRNA

小结

参考文献

文献综述 SARS的研究进展

1 SARS的流行病学研究

1.1 流行情况

1.2 流行特点

1.3 传染源

1.4 传播途径

1.5 其他

2 SARS临床研究

2.1 临床基础研究

2.2 临床分期及其症状

2.3 临床治疗

2.4 中医药在SARS治疗中的作用

3 SARS冠状病毒的基础研究

3.1 冠状病毒简介

3.2 SARS冠状病毒的发现和确证

3.3 超微结构特征

3.4 SARS病毒的复制

3.5 SARS病毒的来源

3.6 SARS的分子生物学研究

4 SARS的防治展望

4.1 疫苗研究

4.2 药物开发

参考文献

致谢

在读期间发表和待发表的论文

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