论文摘要
戊型肝炎（hepatitis E, HE）是由戊型肝炎病毒（hepatitis E virus, HEV）引起的一种经粪-口途径传播的疾病,是一种人畜共患病。戊型肝炎病毒主要侵犯青壮年和孕妇,尤其是孕妇易造成流产、死胎及死亡。长期以来由于缺乏有效的体外细胞培养系统,影响了对HEV复制机理和致病机制等方面的研究。而随着反向遗传学的发展,利用相关技术将病毒RNA转换为cDNA,从而可以在DNA分子水平上对RNA病毒进行研究。反向遗传学的核心是构建病毒感染性克隆,因此本试验在已知HEV SAAS-FX17全基因组序列的基础上构建了病毒全基因组cDNA分子克隆并进行动物试验验证其具有感染性。首先构建HEV全基因组cDNA分子克隆。我们利用基因4型猪HEVSAAS-FX17株全基因组序列中4个单一酶切位点,分别是BamH、 SanDⅠ、 HindⅢ、 Bg1Ⅱ,分5段克隆了HEV的基因组序列。为使克隆的全基因组能插入到合适的载体中,在HEV全基因组的5’端和3’端分别引入SpeⅠ、XbaⅠ酶切位点序列；为使构建的全基因组cDNA可以体外转录,我们在HEV的5’端SpeⅠ酶切序列后加上T7启动子核心序列。将扩增片段连接到pJET1.2Blunt载体上筛选阳性重组质粒,测序正确的质粒保存备用。为了方便5个HEV片段插入克隆载体,我们利用PCR技术对克隆载体pGEM-9Z进行改造,将其多克隆位点替换为SpeⅠ、BamHⅠ、 SanDⅠ、 HindⅢ Bg1Ⅱ XbaⅠ酶切序列,命名为pGEM-9Z-Stuffer.依次将5个HEV片段插入到pGEM-9Z-Stuffer载体中,得到HEV全基因组cDNA克隆pGEM-9Z-HEV。以线性化的pGEM-9Z-HEV为模板,体外转录合成RNA并多点注射到SD大鼠肝脏内。试验组每只注射200pL RNA,对照组注射等量无菌PBS,观察52天,定期采集样品检测粪便中HEV、血清中HEV抗体的变化。检测粪便中HEV RNA结果显示试验组3#、4#大鼠在感染后第23天首先检测到HEV RNA,在第30天所有大鼠粪便内均能检测到HEV RNA,并可持续至第45天。在第52天仅有1#大鼠粪便中能检测到HEV RNA.通过对遗传标记的检测发现阳性大鼠粪便中检测到的HEV基因组中均存在遗传标志,说明拯救的病毒来自人工构建而非野生毒株的污染。血清中HEV抗体检测结果显示3#、4#和5#大鼠HEV抗体在第31天最先阳转,在第38天抗体浓度达到峰值。而1#、2#最晚,在第38天抗体才开始阳转,在第45天达到峰值。通过对HEV RNA检测和抗体检测结果分析发现感染后的SD大鼠最先在粪便中排毒,此后约1周左右血清中HEV抗体才开始阳转,且抗体阳转的早晚与粪便中排毒的早晚有直接关系,粪便越早排毒,其血清中抗体阳转越早。综上所述,本试验建立了基因4型猪HEVSAAS-FX17株全基因组cDNA分子克隆,动物试验结果表明其体外转录本具有感染性。