Rap2诱导HEK293细胞转化机制的研究

论文摘要

Rap2属于Ras家族小分子量G蛋白,与Rap1具有60%的氨基酸序列相似性,其功能尚未得到阐明。近来,Rap2特异的下游靶蛋白RPIP9与肿瘤发生相关的研究结果提示Rap2可能参与体内肿瘤的发生。本研究室的前期研究也表明Rap2的过表达能够诱导HEK293细胞转化表型的形成。为了揭示Rap2在肿瘤发生中可能存在的功能,我们首先检测了Rap2在人肾癌肿瘤组织与正常癌旁组织中的活性化状态,发现人肾癌肿瘤组织中Rap2的活性化程度较正常癌旁组织显著增强,表明Rap2的高活性化与肾癌的发生相关。为了进一步研究Rap2诱导HEK293细胞转化的机制,本研究通过Rap2的瞬时转染及免疫细胞化学的方法研究了Rap2的表达对细胞形态的影响,结果发现,转染Rap2后HEK293细胞失去了原有的铺展状态,明显变圆,细胞微丝骨架结构紊乱,表现出细胞恶性转化的特征。为研究Rap2对细胞微丝骨架形态的调控的信号途径,细胞微丝骨架调控因子RhoA与Rap2被共表达于HEK293细胞中。GST-pull down分析表明Rap2的表达能够抑制外源表达的RhoA的活性,而细胞免疫荧光研究发现RhoA或RhoA活性化突变体RhoA-14V的共表达并不能使Rap2诱导的细胞微丝骨架紊乱得以恢复。因此,Rap2可能通过RhoA以外的信号途径调控细胞微丝骨架的组装。重组基底膜侵袭实验结果表明,稳定表达外源Rap2的HEK293细胞的侵袭能力明显高于非外源表达Rap2的对照组,表明Rap2的过量表达能够增强细胞的运动和侵袭能力。综上,Rap2可能作为原癌基因在肾癌发生中起调控作用,其诱导细胞转化的机制涉及到了微丝细胞骨架形态和细胞侵袭能力的调控。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 课题背景
• 1.2 国内外研究现状
• 1.2.1 Ras家族G蛋白
• 1.2.2 Rap2 特异的下游效应因子
• 1.2.3 Rap2 信号途径在非洲爪蟾发育中的功能
• 1.2.4 Rap2 调节B细胞形态、细胞黏附和细胞迁移
• 1.2.5 Rap2 在神经发育中的功能
• 1.3 肿瘤转移的分子机制研究
• 1.3.1 细胞骨架与肿瘤的转移
• 1.3.2 细胞骨架与肿瘤的转移
• 1.4 课题目的和意义
• 1.5 技术路线
• 第2章 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 细胞系
• 2.1.2 载体
• 2.1.3 主要试剂及配制
• 2.1.4 主要仪器及耗材
• 2.1.5 分析软件
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 组织样品中Rap2 蛋白活性化分析
• 2.2.2 Rap2 对细胞骨架微丝的影响
• 2.2.3 Rap2 对细胞侵袭能力的影响
• 2.2.4 Rap2 对RhoA的调控
• 2.3 本章小结
• 第3章 组织样品中Rap2 蛋白活性化分析
• 3.1 引言
• 3.2 人肾组织样品
• 3.3 蛋白质浓度曲线——Lowry检测法
• 3.3.1 原理
• 3.3.2 Lowry标准曲线
• 3.4 组织样品中Rap2 蛋白活性化分析结果
• 3.5 讨论
• 3.6 本章小结
• 第4章 Rap2 对细胞骨架微丝的影响
• 4.1 引言
• 4.2 细胞骨架微丝形态的免疫染色
• 4.2.1 间接免疫荧光法测抗体实验原理
• 4.2.2 免疫染色结果
• 4.3 微丝形态检测
• 4.4 讨论
• 4.5 本章小结
• 第5章 Rap2 对细胞侵袭能力的影响
• 5.1 引言
• 5.2 细胞重组基底膜侵袭实验
• 5.2.1 原理
• 5.2.2 实验结果
• 5.2.3 讨论
• 5.3 本章小结
• 第6章 Rap2 对RhoA的调控作用
• 6.1 重组体的构建结果
• 6.1.1 RhoA PCR 结果
• 6.1.2 GFP-RhoA菌液PCR即测序结果
• 6.2 微丝组装调控因子RhoA的活性分析
• 6.2.1 GST Rhotekin-RBD融合蛋白的诱导与表达
• 6.2.2 RhoA活性分析
• 6.3 Rap2 与RhoA对细胞骨架的影响
• 6.4 讨论
• 6.5 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 附录Ⅰ SPSS方差分析基底膜侵袭能力
• 附录Ⅱ RhoA测序结果
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢