去神经支配后对鼠肺神经内分泌细胞影响的实验研究

论文摘要

肺神经内分泌细胞（PNEC）系统是由单个PNEC及成簇的PNEC形成的神经上皮小体（NEB）组成。已知PNEC具有气道氧化学感受器,调节气道反应性,促进肺的生长发育的功能。近来还发现PNEC可作为气道上皮干细胞促进肺损伤后修复,PNEC与小细胞肺癌密切相关。这些功能的发挥主要通过迷走神经节的感觉传入神经纤维支配。NEB中存在双重感觉神经纤维支配。一是由迷走神经结状神经节的钙结合蛋白D28K和P2X3受体免疫神经纤维组成的感觉神经纤维;另一是由背根神经节的P物质和降钙素基因相关肽（CGRP）免疫反应性神经纤维组成。CGRP在神经节中合成后随之被转运到神经末梢,通过迷走神经传入神经元调节其行为。从气道近端至远端双重感觉神经纤维的密度逐渐降低直至单个神经纤维穿过气道上皮及上皮下层,单个PNEC及NEB可能通过粘膜下层的微细神经纤维相互连接。单侧迷走神经切断后会出现同侧的神经末梢退化或消失,PNEC及NEB也可能会出现相应改变。临床在气管、支气管成形术及肺移植过程中,由于切断了支配支气管粘膜及肌肉的神经纤维,去神经支配后肺神经内分泌细胞的数量、分布及神经活性物质分泌功能的改变;PNEC对于神经刺激的应答,PNEC产生的神经免疫、神经内分泌的功能,以及这些改变对于气管、支气管粘膜的修复有何影响?目前尚不清楚。因此,研究去神经支配后肺神经内分泌细胞数量、分布及神经活性物质的分泌功能的改变,具有十分重要的意义。研究目的通过切断鼠单侧迷走神经和支气管重建观察去神经后PNEC和NEB的数量、形态结构及其分泌神经活性物质的变化,以探讨PNEC的功能及其在气道损伤及修复中的作用。实验方法1.30只SD大鼠切断左侧迷走神经,术后按取样时间随机分为术后一周、一月、三月组,每组10只;另设10只正常SD大鼠作为对照组。电镜观察肺神经内分泌细胞的超微结构;采用Grimelius银染色法观察肺神经内分泌细胞数量及分布;免疫组化法检测五羟色胺阳性神经内分泌细胞、降钙素基因相关肽阳性神经内分泌细胞的表达;采用放射免疫分析法测定血清中CGRP浓度;RT-PCR法测定肺组织CGRP mRNA表达。2.30只SD大鼠左侧支气管重建术,术后按取样时间随机分为术后一周、一月、三月组,每组10只;另设10只正常SD大鼠作为对照组。HE切片观察支气管重建术后支气管愈合情况;采用Grimelius银染色法观察肺神经内分泌细胞数量及分布;免疫组化法检测五羟色胺阳性神经内分泌细胞、降钙素基因相关肽阳性神经内分泌细胞的表达;采用放射免疫分析法测定血清中CGRP浓度;RT-PCR法测定肺组织CGRP mRNA表达。实验结果1.PNEC超微结构:电镜下见PNEC分布于肺内支气管和细支气管上皮内,PNEC呈烧瓶样、卵圆形和锥型,细胞从上皮基底膜延伸至支气管管腔或者沿基底膜在相邻气道上皮间伸展,顶端狭窄形成尖形突起抵达管腔,有些细胞顶端靠近腔面处常有短微绒毛。在细胞浆中富含具有特征性的致密核心小泡（DCV）,一般呈球状,直径约70～200nm,外被单位膜,内含电子高密度的核心,核心和膜之间有一薄的光晕。PNEC内可见数量不等的游离核蛋白体、光面内质网与粗面内质网、成束的微丝和线粒体,线粒体较相邻细胞的更小,高尔基体位于细胞核靠上处。2.迷走神经切断术后一周和一月Grimelius银染色见神经内分泌细胞多位于肺内支气管上皮,其数量大幅度增加,且有多个神经内分泌细胞聚集形成神经上皮小体;至三月接近正常对照组;进一步免疫组化检测见迷走神经切断术后一周、一月大支气管内5-HT、CGRP阳性PNEC和NEB数量大量增加（P﹤0.01）,至术后三月时接近正常对照组（P﹥0.05）。小支气管、周围细支气管内5-HT、CGRP阳性PNEC和NEB数量无显著差异（P﹥0.05）。3.迷走神经切断术后一周和一月血清CGRP含量比正常对照组显著降低（P﹤0.01）,随着时间延长,血清中CGRP含量逐渐增加,至三月时接近正常对照组;而肺组织CGRP mRNA表达在术后一周和一月均明显高于对照组（P﹤0.01）,随着时间的延长,其表达量逐渐减少,至术后三月时接近正常对照组（P﹥0.05）。4.支气管重建术后支气管吻合口肉芽组织增生,可见支气管粘膜中断,内皮细胞增生形成的实性细胞索及扩张的毛细血管,毛细血管周围可见大量的纤维母细胞及炎性细胞。5.支气管重建术后一周和一月Grimelius银染色见神经内分泌细胞多位于肺内支气管上皮,其数量大幅度增加,且有多个神经内分泌细胞聚集形成神经上皮小体;至三月接近正常对照组;进一步免疫组化检测见支气管重建术后一周、一月大支气管内5-HT、CGRP阳性PNEC和NEB数量大量增加（P﹤0.01）,至术后三月时接近正常对照组（P﹥0.05）。小支气管、周围细支气管内5-HT、CGRP阳性PNEC和NEB数量无显著差异（P﹥0.05）。6.支气管重建术后一周和一月血清CGRP含量比正常对照组显著降低（P﹤0.01）,随着时间延长,血清中CGRP含量逐渐增加,至三月时接近正常对照组;而肺组织CGRP mRNA表达在术后一周和一月均明显高于对照组（P﹤0.01）,随着时间的延长,其表达量逐渐减少,至术后三月时接近正常对照组（P﹥0.05）。结论1.神经内分泌细胞的超微结构特征——细胞浆中致密核心小泡（DCV）可作为PNEC特征性标志。2.迷走神经切断后可明显影响肺神经内分泌细胞数量、分布及神经活性物质的分泌,从而表明迷走神经具有支配、调节肺神经内分泌细胞分化及分泌神经活性物质的功能。3.迷走神经切断后血清内CGRP浓度下降及肺内CGRP mRNA表达量增加之变化,表明迷走神经对CGRP基因的表达和神经活性物质CGRP的分泌具有调节作用。4.支气管重建术后PNEC的数量增加及5-HT,CGRP阳性PNEC和NEB大量增生,一方面表明PNEC受其支配的神经纤维调节,另一方面表明PNEC可能参与了气道的损伤与修复。5.支气管重建术后近期血清内CGRP浓度下降及肺内CGRP mRNA表达量增加之变化,表明肺内CGRP-IR神经纤维调节CGRP基因的表达和神经活性物质CGRP的分泌;推测CGRP具有局部调节因子刺激内皮细胞增生,参与了气道的损伤与修复。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 正文
• 实验一 切断单侧迷走神经后鼠肺神经内分泌细胞的研究
• 1 材料
• 2 实验方法
• 3 统计学分析
• 4 结果
• 5 讨论
• 实验二 支气管重建术后鼠肺神经内分泌细胞的研究
• 1 材料
• 2 实验方法
• 3 统计学分析
• 4 结果
• 5 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 个人简历和研究成果
• 致谢