羊肌细胞生成素（MyoG）基因的克隆、表达及成肌活性研究

论文摘要

肌细胞生成素（1myogenin, MyoG）是生肌调节因子（1myogenic regulatory factors, MRFs）家族成员之一,属于bHLH型蛋白。MyoG主要参与调解成肌细胞融合成肌管这一过程,在胚胎发育期的成肌作用不可替代,其异位表达可以促使非肌细胞向肌肉方向分化,并且MyoG基因是MRFs家族中唯一可在所有骨髂肌细胞系中均可表达的基因。目前,对该基因的表达、定位及功能的研究主要集中在小鼠、大鼠、斑马鱼等模式生物上,对羊MyoG生物学活性以及利用MyoG生产转基因动物的研究还未见报道。因此,本研究通过克隆羊MyoG基因,进行体外表达、亚细胞定位、成肌活性检测,为高产肉性能转基因羊生产提供重要参考。主要研究内容如下：1. MyoG基因的克隆及序列分析。利用PCR技术从湖羊基因组DNA中扩增出MyoG基因的三个外显子,再通过重叠延伸PCR将外显子拼接成一段完整ORF,并将其克隆至pMD19-T载体中。酶切及测序结果均表明pMD19-T-MyoG构建正确,MyoG基因ORF正确无误。序列比对结果显示,克隆片段与GenBank上发表的波尔山羊（FJ607135）、牛（NM-001111325）、猪（NM-001012406）、小鼠（NM-031189）的MyoG基因序列的同源性分别为99.26%、97.04%、92.00%、87.70%。蛋白质结构域预测显示,由克隆片段翻译的氨基酸序列具有典型的bHLH结构。说明克隆的MyoG基因正确无误,具有发挥生物学活性的结构基础,可以用于后续研究。2.重组MyoG的表达及其亚细胞定位的研究。构建携带报告基因EGFP的融合蛋白表达载体pEGFP-C1-MyoG,脂质体介导体外转染鼠NIH-3T3细胞、鸡胚成纤维细胞（CEF）、羊胎儿成纤维细胞（GEF）。转染48h后,荧光倒置显微镜下观察绿色荧光在细胞中的分布,分析MyoG蛋白在细胞中的定位情况。同时提取转染细胞总RNA及总蛋白,利用RT-PCR、Western Blot检测融合蛋白在NIH-3T3细胞内的表达。结果显示,RT-PCR、Western Blot均能检测到融合蛋白的表达,MyoG蛋白在不同物种细胞中定位无差异,均位于细胞核中,与生物信息学软件预测结果一致,3. MyoG基因成肌活性研究。将前期克隆的羊MyoG基因CDS插入真核表达载体pcDNA3.0,鉴定正确后,重组载体pcDNA3.0-MyoG体外转染GEF, G418压力筛选18d后获得阳性细胞,扩大培养,间接免疫荧光（IFA）检测结蛋白（Desmin）的表达,然后更换培养基进行分化培养,观察细胞形态的变化。结果IFA能检测到Desmin的表达,分化培养2d细胞发生融合,出现肌管形态,5d后肌管大量出现,证明MyoG基因体外具有成肌活性,能诱导非肌细胞向肌肉分化。4.体内精原干细胞介导生产转基因羊。酶切重组质粒pEGFP-C1-MyoG使其线性化,利用聚乙烯亚胺（PEI）介导,通过随机打点法将目的载体注射入公羊睾丸,体内转染精原干细胞（SSCs）。注射公羊与正常母羊自然交配,生产后代,检测外源基因在F1代基因组中的整合及表达情况。PCR、DNA斑点杂交结果表明,外源基因MyoG、EGFP均己整合到后代基因组中,山羊F1代PCR、DNA点杂交阳性率为25.6%（7/27）；绵羊F1代PCR、DNA点杂交阳性率为17.9%（5/28）,Western Blot显示F1代山羊、绵羊各有2头表达外源基因,阳性率分别为7.4%（2/27）、7.1%（2/28）。表明睾丸内注射法可能是一种简单有效的生产转基因动物的方法。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 符号说明
• 第一章 文献综述
• 1 骨骼肌发育过程概述
• 1.1 骨骼肌的胚胎起源
• 1.2 骨骼肌的发生过程
• 2 MRFS家族概况
• 3 MYoG基因研究进展
• 3.1 MyoG基因的结构
• 3.2 MyoG基因的生物学功能
• 3.3 MyoG的表达模式
• 3.4 MyoG表达的调节
• 4 精原干细胞介导转基因研究进展
• 参考文献
• 第二章 羊MYOG基因的克隆及序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 血样、菌种
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器设备
• 1.4 引物设计
• 1.5 湖羊基因组DNA的提取
• 1.6 MyoG基因三个外显子的扩增
• 1.7 MyoG外显子2、3的拼接
• 1.8 MyoG全长CDS的扩增
• 1.9 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 1.10 MyoG基因的T-A克隆
• 1.11 MyoG基因序列同源性分析
• 1.12 MyoG蛋自的结构域分析
• 2 结果
• 2.1 MyoG基因三个外显子的扩增与拼接
• 2.2 MyoG全长CDS的扩增
• 2.3 MyoG基因的T-A克隆
• 2.4 测序结果
• 2.5 MyoG基因序列同源性分析
• 2.6 MyoG蛋白结构域分析
• 3 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 第三章 重组MYOG的表达及其亚细胞定位的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 菌种、质粒与细胞株
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器设备
• 1.4 引物的设计与合成
• 1.5 目的基因的PCR扩增及产物的纯化
• 1.6 重组质粒pEGFP-C1-MyoG的构建及鉴定
• 1.7 MyoG蛋白亚细胞定位预测
• 1.8 转染用细胞的制备
• 1.9 重组质粒pEGFP-C1-MyoG转染细胞
• 1.10 RT-PCR检测融合蛋白在NIH-3T3中的表达
• 1.11 Western Blot检测融合蛋白在NIH-3T3中的表达
• 2 结果
• 2.1 目的基因的PCR扩增
• 2.2 pEGFP-C1-MyoG融合蛋白表达载体的构建
• 2.3 MyoG蛋白亚细胞定位预测
• 2.4 融合蛋白在细胞中的定位
• 2.5 RT-PCR检测MyoG的表达
• 2.6 Western Blot检测融合蛋白的表达
• 3. 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 第四章 MYOG成肌活性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 菌种、质粒
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器设备
• 1.4 引物的设计与合成
• 1.5 目的基因的PCR扩增及产物的纯化
• 1.6 重组质粒pcDNA3.0-MyoG的构建及鉴定
• 1.7 转染用细胞的制备
• 1.8 G418对GEF细胞最小致死量的测定
• 1.9 GEF细胞转染条件的优化
• 1.10 pcDNA3.0-MyoG质粒的稳定转染
• 1.11 IFA检测转染细胞
• 1.12 转染细胞形态学观察
• 2 结果
• 2.1 目的基因的PCR扩增
• 2.2 重组质粒pcDNA3.0-MyoG的构建
• 2.3 转染用细胞GEF的制备
• 2.4 G418对GEF最小致死浓度的确定
• 2.5 GEF最佳转染条件的优化
• 2.6 稳定整合MyoG基因细胞的获得
• 2.7 IFA检测Desmin的表达
• 2.8 转染细胞形态学观察
• 3 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 第五章 精原干细胞体内介导生产转基因羊
• 1 材料与方法
• 1.1 质粒与实验用羊
• 1.2 主要试剂
• 1.3 注射用质粒的准备
• 1.4 转染液的配制
• 1.5 睾丸内注射pEGFP-C1-MyoG质粒
• 1代羔羊基因组DNA PCR检测'>1.6 F₁代羔羊基因组DNA PCR检测
• 1代羔羊基因组DNA点杂交检测'>1.7 F₁代羔羊基因组DNA点杂交检测
• 1代羔羊组织蛋白Western Blot检测'>1.8 F₁代羔羊组织蛋白Western Blot检测
• 2 结果
• 2.1 pEGFP-C1-MyoG质粒线性化酶切
• 1代羔羊基因组DNA PCR检测'>2.2 F₁代羔羊基因组DNA PCR检测
• 1代羔羊基因组DNA点杂交检测'>2.3 F₁代羔羊基因组DNA点杂交检测
• 1代中的表达'>2.4 Western Blot检测融合基因在F₁代中的表达
• 3 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间发表的论文