对PRMT5几个缺失突变体的功能及其与GM130之间相互作用的研究

论文摘要

蛋白精氨酸甲基化是一种普遍存在于细胞核和细胞质中的翻译后修饰现象,由精氨酸甲基转移酶家族（PRMTs）催化产生。越来越多的实验证明蛋白甲基化参与了生命活动的各个过程,包括RNA的加工和转运、蛋白翻译、基因转录、信号转导和DNA修复等。大多数PRMTs作用于底物中的赖氨酸和精氨酸的富集区（GAR motifs）。根据将S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine,AdoMet）上的甲基转移到精氨酸的胍基氮上产生甲基化的不同方式,最终可以分为三类:单甲基化（MMA）、对称性双甲基化（sDMA）和非对称性双甲基化（aDMA）。PRMTs可以分为类型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ四种类型。Ⅰ类和Ⅱ类都可以催化产生单甲基化（MMA）,不同点在于:Ⅰ类（PRMT1,3,4,6和8）催化产生非对称性双甲基化（aDMA）,而Ⅱ类（PRMT5,PRMT7和FBXO11）催化产生对称性双甲基化（sDMA）,PRMT7也呈现Ⅲ类酶的特点,在一些底物倾向于催化产生单甲基化（MMA）,但是并不产生对称性双甲基化（sDMA）,Ⅳ型酶在酵母中催化瓜基上的单原子氮。蛋白质精氨酸甲基转移酶5（PRMT5）在细胞生长和信号转导方面是一个重要的调节因子,主要参与染色质重塑、RNA剪切、基因转录、细胞分化等过程。因此,对其结构和功能的研究就显得十分重要。通过大肠杆菌表达系统把全长基因PRMT5构建到pGEX-4T-1表达载体上,所得到GST标签的重组蛋白可溶性很低。为此,通过在其N端缺失不同氨基酸序列来增加其表达量,而且其中有一个缺失突变体的活性并没有发生改变。同时,我们还发现PRMT5的N端的前15个氨基酸对其甲基转移酶的催化活性很重要。高尔基体在蛋白翻译后修饰,蛋白分类和运输发挥着重要作用,而在维持高尔基体的结构和控制高尔基体组装方面,依赖于两类重要的蛋白,即golgin蛋白和GRASPs（Golgi Re-Assembly Stacking Proteins）蛋白。其中GRASPs也称为Golgi matrix蛋白,包括Giantin,GM130,GRASP6,它们都是维持高尔基的组装所必须的蛋白。蛋白的翻译后修饰,例如GM130的磷酸化对高尔基体的结构十分重要。本实验室已经发现在Hela细胞质中分离提取了PRMT5复合体,并对其中的几个重要组分进行了质谱分析,其中一个在高尔基体结构和功能中发挥重要作用的组分GM130。为了证明PRMT5和GM130之间的相互作用,我们进行了Farwestern实验。实验结果显示,GM130通过其N端的前73个氨基酸结合于PRMT5的保守区域（C端）。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 一、文献综述
• 1.1 蛋白甲基化修饰
• 1.2 蛋白精氨酸甲基化
• 1.3 精氨酸甲基化调节细胞的过程
• 1.4 精氨酸甲基化的自身调节
• 1.5 精氨酸甲基转移酶与疾病
• 1.6 PRMT5的研究进展
• 二 材料和方法
• 2.1 材料和仪器
• 2.1.1 材料与试剂
• 2.1.2 仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 RMT5相关载体的构建
• 2.2.2 蛋白表达纯化
• 2.2.3 分子筛（Superdex-200）
• 2.2.4 质谱分析（MS）
• 2.2.5 甲基转移酶活性分析
• 2.2.6 用Far Western印迹来检测蛋白质-蛋白质相互作用
• 2.2.7 细胞常规培养
• 2.2.8 细胞的瞬时转染
• 三 实验结果
• 3.1 对PRMT5几个缺失突变体的功能研究
• 3.1.1 PRMT5各种不同突变体的载体构建
• 3.1.2 PRMT5的体外表达及其纯化
• 3.1.3 PRMT5各种突变体的体外表达及其纯化
• 3.1.4 不同PRMT5突变体的体外活性研究
• 3.1.5 MEP50的表达纯化及其对PRMT5催化活性的影响
• 3.2 PRMT5与GM130之间的相互作用
• 3.2.1 GM130不同片段的载体构建及表达纯化
• 3.2.2 FarWestern检测PRMT5与GM130之间的相互作用
• 四 讨论与结论
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间研究成果及参与的科研项目