猪α干扰素和白细胞介素-2在真核细胞中表达及其表达产物活性分析

论文摘要

目的：α干扰素（interferon-a）是一种具有广谱抗病毒、抗肿瘤及免疫激活功能的细胞因子,白细胞介素2在抗肿瘤、免疫调节及感染性疾病的治疗中也具有重要作用,同时它还能激活B淋巴细胞,参与机体的体液免疫应答,促进抗体分泌,增强体液免疫应答。Mx蛋白是Ⅰ型和Ⅲ型干扰素（IFN）诱导细胞后产生的天然抗病毒蛋白,有很好抗病毒活性,且副作用小。本实验将猪α干扰素基因和白细胞介素2基因分别转染真核细胞,检测这两个基因的表达,及表达产物的抗病毒活性。为将这两个基因用于疫苗佐剂及转基因抗病育种动物奠定了基础。同时也克隆了猪Mxl基因启动子及Mxl基因,并构建了真核表达载体,为进一步研究猪Mxl基因奠定了基础。方法：（1）根据已发表的猪IFN-a和猪IL-2基因的核酸序列设计引物,克隆出这两个基因,鉴定正确后将两个基因分别连到pcDNA3.1载体上构建真核表达载体,分别命名为pcDNA3.1-IFN、pcDNA3.1-IL;（2）用构建好的真核表达载体分别转染真核细胞通过G418筛选出转染外源基因的细胞,并用RT-PCR进一步检测是否整合外源基因；（3）采用实时定量PCR检测猪IFN-α和IL-2基因在真核细胞内mRNA表达水平、采用ELISA方法检测猪IFN-α和IL-2基因在真核细胞内蛋白表达水平、采用淋巴细胞增殖实验测猪IFN-α和IL-2基因在真核细胞内表达蛋白的生物学活性。（4）根据Genbank已公布的猪Mxl基因启动子、Mxl基因的核苷酸序列,设计合成两对特异引物分别扩增了猪Mxl基因启动子和Mxl基因,并将这两个基因亚克隆到含有G418筛选标记的PGKneotpALox2真核表达载体上结果：（1）成功克隆了猪IFN-α和猪IL-2基因,经测序鉴定正确,并将其分别连到pcDNA3.1真核表达载体上构建成功pcDNA3.1-IFN、pcDNA3.1-IL转染质粒。（2）通过G418筛选出稳定表达猪IFN-α和猪IL-2基因的真核细胞,经RT-PCR鉴定为阳性。（3）实时定量PCR表明转入猪IFN-α基因的真核细胞其IFN-αmRNA表达量高于阴性未转染组1.52倍,转入猪IL-2基因的真核细胞其IL-2 mRNA表达量高于阴性未转染组1.43倍；对整合外源基因真核细胞上清液ELISA检测结果显示,猪IFN-α的含量为121.45pg/mL,而未转染该基因的对照组含量为89.36pg/mL转染组高于对照组1.35倍。猪IL-2的含量为97.45pg/mL,而未转染对照组含量为75.36 pg/mL转染组高于对照组1.29倍；经SPSS统计软件分析表明整合外源基因的真核细胞上清液淋巴细胞增殖作用与阴性对照组相比均差异显著,表明这两个基因的表达产物有很好的活性,可以用来抗病毒。（4）成功克隆了猪Mxl基因启动子和Mxl基因并将这两个基因亚克隆到PGKneotpALox2真核表达载体上。结论：猪IFN-a和猪1L-2基因可以在真核细胞中很好表达,且表达产物具有很好的活性,为开发新型基因工程疫苗佐剂和转基因抗病动物奠定了基础。同时本实验也构建了猪Mxl真核表达载体,为进一步研究Mxl基因提供了实验基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略表
• 引言
• 第一章 文献综述 猪A干扰素与白细胞介素2研究进展
• 1 A干扰素研究进展
• 1.1 α干扰素简介
• 1.2 α干扰素结构特征及分子生物学特性
• 1.3 α干扰素产生机理
• 1.4 α-干扰素的信号转导路径
• 1.5 α-干扰素的作用机理
• 1.6 α-干扰素的生物学活性
• 1.7 α-干扰素基因工程研究
• 1.8 α-干扰素的应用及前景展望
• 1.9 INF-α研究在预防兽医学中的意义
• 2 白细胞介素2研究进展
• 2.1 白细胞介素2简介
• 2.2 白细胞介素2核酸及蛋白结构特征
• 2.3 IL-2的应用
• 第二章 实验研究
• 实验一 猪IFN-A、IL-2基因的克隆及序列分析
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 PoIFN-α、PoIL-2 基因引物设计
• 1.3 猪外周血淋巴细胞分离与培养
• 1.4 淋巴细胞总RNA提取及反转采
• 1.5 PoIFN-α、PoIL-2基因的扩增
• 1.6 目的基因的回收与连接
• 1.7 连接产物分别转化大肠杆菌DH5α感受态细胞
• 1.8 pMD18-IFN、pMD18-IL重组质粒的鉴定
• 1.9 PoIFN-α基因和PoIL-2基因的序列测定及分析
• 2 结果
• 2.1 PoIFN-α基因和PoIL-2基因的RT-PCR扩增结果
• 2.2 PoIFN-α基因和PoIL-2基因重组质粒菌液PCR鉴定
• 2.3 PoIFN-α基因和PoIL-2基因重组质粒双酶切鉴定
• 2.4 PoIFN-α基因和PoIL-2基因核苷酸序列的分析
• 3 讨论
• 实验二 PoIFN-A和PoIL-2基因转染真核细胞及筛选
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 PoIFN-α和PoIL-2基因真核表达载体的构建
• 1.3 PoIFN-α和PoIL-2基因真核表达载体的鉴定
• 1.4 PoIFN-α和PoIL-2基因重组质粒转染真核细胞
• 2 结果
• 2.1 pcDNA3.1-IFN、pcDNA3.1-IL真核表达载体的PCR鉴定结果
• 2.2 pcDNA3.1-IFN、pcDNA3.1-IL真核表达载体的酶切鉴定结果
• 2.3 转入外源基因的真核细胞G418筛选结果
• 2.4 整合外源基因的真核细胞RT-PCR鉴定结果
• 3 讨论
• 实验三 PoIFN-A和PoIL-2基因在真核细胞内表达,及表达产物活性分析
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 PoIFN-α和PoIL-2基引mRNA表达Real-time检测
• 1.3 PoIFN-α和PoIL-2基因表达蛋白表达的ELISA检测
• 1.4 重组PoIFN-α和PoIL-2产物的淋巴细胞增殖实验
• 2 结果
• 2.1 实时荧光定量标准载体目的片段克隆结果
• 2.2 实时荧光定量标准载体目的片段测序结果
• 2.3 PoIFN-α基因、PoIL-2基因和β-actin基因的标准曲线结果
• 2.4 PoIFN-α、PoIL-2基因在真核细胞中表达的CT值分析结果
• 2.5 外源基因表达的ELISA检测结果
• 2.6 外源基因表达产物的促淋巴细胞增殖实验结果
• 3 讨论
• 实验四 猪Mx1基因启动子及Mx1基因扩增
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 Mx1启动子、Mx1基因引物设计
• 1.3 猪外周血淋巴细胞分离与培养
• 1.4 淋巴细胞总RNA提取及反转录
• 1.5 猪Mx1启动子、Mx1基因的RT-PCR扩增
• 1.6 目的基因的回收与连接
• 1.7 连接产物分别转化感受态细胞及蓝白斑筛选
• 1.8 Mx1启动子载体和Mx1载体的鉴定
• 1.9 Mx1启动子和Mx1基因真核表达载体的构建及鉴定
• 2 结果
• 2.1 Mx1启动子基因和Mx1基因的RT-PCR扩增结果
• 2.2 PGK-MP和PMD18-Mx1载体重组质粒的鉴定
• 2.3 PGK-Mx1P-Mx1真核表达载的鉴定
• 2.4 PGK-Mx1P-Mx1构建后图谱及PGKneotpALox2载体图谱
• 3 讨论
• 结论
• 创新点
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 导师评阅表