LPAAT蛋白家族与肿瘤转移相关性的研究

论文摘要

肿瘤转移始终是肿瘤防治工作中面临的难题，只有有效控制、阻断肿瘤转移才可能实现肿瘤的治愈。肿瘤在演进过程中，一些肿瘤细胞具有了侵袭和转移能力，而这种转移表型的获得在很大程度上是由于肿瘤细胞内基因发生异常改变引起的。目前，从分子水平揭示肿瘤转移的本质，研究肿瘤转移相关基因成为肿瘤转移研究的热点。溶血磷脂酸酰基转移酶（Lysophosphatidicacidacyltransferase，LPAAT）是细胞内参与磷脂生成及代谢的酶类，能够催化酰基辅酶A上的酰基转移到溶血磷脂酸（LPA）生成磷脂酸（PA），LPAAT蛋白家族目前已发现有8个成员，有研究发现，LPAAT在髓性白血病细胞中表达上调，而且其表达水平与白血病细胞的异常增殖和耐药性有关[1]。还有研究表明LPAAT在卵巢癌细胞中表达上调，并且其表达水平与肿瘤的恶性程度及预后相关[2,3]。本实验主要以溶血磷脂酸酰基转移酶家族成员—LPAAT-theta(又称mag-1，metastasisassociatedgene-1)和LPAAT-beta作为研究对象，通过改变mag-1在肿瘤细胞内的表达水平，研究实验动物体内肿瘤转移发生的变化情况，以及肿瘤转移细胞对微环境适应能力；通过改变LPAAT-beta在肿瘤细胞内的表达水平，初步探讨LPAAT-beta与肿瘤转移的相关性。为了解LPAAT蛋白家族在肿瘤转移过程中的功能和分子机制提供依据。主要研究结果如下：（1）mag-1与肿瘤转移相关性的研究通过小鼠体内自发成瘤和转移实验确定mag-1与肿瘤转移的关系。以shRNA敲低mag-1的表达，敲低实验组小白鼠乳腺生成原发瘤的平均重量为2.065±0.241g，而空白组与无关干涉组小鼠乳腺生成的原发瘤的平均重量分别为3.998±0.597g和3.268±0.638g。敲低实验组小于空白组和无关干涉组；而且敲低实验组小白鼠肺部生成肿瘤转移灶个数平均为0.889±0.269个，而空白组与无关干涉组小鼠肺部生成的转移灶个数平均分别为7.182±1.146个和9.143±1.033个。敲低实验组的数量明显少于空白组和无关干涉组。说明干涉mag-1的表达不仅能够抑制原发瘤的生长，而且还能够抑制肿瘤转移的发生发展。（2）mag-1对肿瘤生长与转移微环境的适应研究增强HIF-1a蛋白稳定性的研究。上调mag-1的表达能够增加肿瘤细胞内HIF-1a蛋白的表达；反之，下调mag-1的表达能够减少肿瘤细胞内HIF-1a蛋白的表达。进一步实验证实，mag-1过表达能够增加肿瘤细胞内HIF-1a蛋白的稳定性，延长HIF-1a蛋白的半衰期，从而增加了肿瘤细胞内HIF-1a蛋白的积累量。在mag-1对HIF-1a下游靶基因的调控研究发现，mag-1过表达实验组H1299细胞中HIF-1a基因活性为0.612±0.014，空载组H1299细胞中HIF-1a基因活性为0.434±0.010；在氧气浓度为0.5%的低氧条件下，mag-1过表达实验组H1299细胞中HIF-1a基因活性为1.139±0.092，空载组H1299细胞中HIF-1a基因活性为0.985±0.044；而且在正常细胞（猴肾成纤维细胞cos7）内同样能够增加HIF-1a蛋白基因的活性；同时检测HIF-1a蛋白下游靶基因发现，mag-1过表达上调了VEGF、Glut-1等基因的表达水平。说明mag-1能够增强HIF-1a的基因活性，激活HIF-1a下游靶基因的表达水平，增强了肿瘤细胞对低氧的适应能力。（3）LPAAT家族成员LPAAT-beta与肿瘤转移相关性的研究。通过检测LPAAT-beta在多种肿瘤细胞系中的表达可知，LPAAT-beta在多种肿瘤细胞系中的表达存在差异，其中在HELF、PLA801C细胞系中的表达水平较低，在HeLa、A549细胞系中较高。之后，利用人胚肺成纤维细胞HELF进行了转染LPAAT-beta与mag-1单克隆稳定细胞株的筛选鉴定。获得了LPAAT-beta相对高表达单克隆稳定细胞株C7、C3、F4，以及mag-1相对高表达单克隆稳定细胞株D9、D6、D4。在此基础上，利用体外细胞生物学实验测定了细胞增殖能力变化，稳定过表达LPAAT-beta和mag-1的实验组OD值分别为0.435和0.408，与这两组相比，空白组和空载组细胞在培养到第6天所测到的OD值分别为0.183和0.188。LPAAT-beta与mag-1过表达实验组的增殖能力高于空白组和空载组。而且，与空白组和空载组相比，LPAAT-beta与mag-1过表达实验组的迁移、粘附能力也都相对较高。说明LPAAT-beta与mag-1这一对基因都能够增强细胞增殖、粘附、迁移等细胞生物学行为。由此认为，LPAAT-beta同样与肿瘤转移具有相关性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1. 文献综述
• 1.1 DNA甲基化与肿瘤转移
• 1.2 microRNAs与肿瘤转移
• 1.3 组蛋白修饰与肿瘤转移
• 1.4 染色质重塑与肿瘤转移
• 1.5 总结与展望
• 2. 引言
• 3. 材料与方法
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 细胞株
• 3.1.2 质粒
• 3.1.3 实验动物
• 3.2 试验设计
• 3.3 主要试验仪器与试剂
• 3.3.1 主要试验仪器
• 3.3.2 主要试剂
• 3.4 常用溶液的配制
• 1. RPMI1640细胞培养基的配制
• 2. DMEM细胞培养基的配制
• 3. 细胞冻存液
• 4. PBS
• 5. 胰蛋白酶消化液
• 6. 30%丙烯酰胺
• 7. 1.5M Tris-Cl （pH8.8）
• 8. 1.0M Tris-Cl （pH6.8）
• 9. 10%AP
• 10. 10%SDS
• 11. 5×SDS-PAGE凝胶电泳缓冲液
• 12. 电转移缓冲液
• 13. 10×TBST
• 14. 封闭液
• 15. 显影液
• 16. 定影液
• 17. LB培养基
• 18. LB固体培养基
• 19. 1%BSA
• 3.5 实验方法
• 1. 细胞培养
• 2. Western blot实验
• 3. RT-PCR实验
• 4. 大肠杆菌的转化
• 5. 质粒提取
• 6. 细胞转染
• 7. 稳定单克隆筛选
• 8. MTT法测定细胞生长曲线
• 9. 细胞粘附实验
• 10. 细胞迁移实验
• 11. 动物实验
• 12. 双报告基因实验
• 4. 结果与分析
• 4.1 mag-1与肿瘤转移相关性的研究
• 4.2 mag-1对肿瘤生长和转移微环境的适应研究
• 4.2.1 HIF-1a蛋白表达量研究
• 4.2.2 HIF-1a基因转录活性研究
• 4.2.3 HIF-1a下游靶基因表达水平检测
• 4.3 LPAAT家族成员LPAAT-beta与肿瘤转移相关性的研究
• 5. 讨论
• 5.1 mag-1与肿瘤转移相关性的研究
• 5.2 mag-1对肿瘤生长和转移微环境的适应研究
• 5.3 LPAAT家族成员LPAAT-beta与肿瘤转移相关性的研究
• 6. 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介
• 在读硕士期间发表的论文