β-D-半乳糖苷酶的发酵生产、分离纯化和性质研究

论文摘要

β-D-半乳糖苷酶（EC3.2.1.23）属于水解酶,催化半乳糖基转移反应生成低聚半乳糖。食品工业中应用该酶催化乳糖转半乳糖苷基水解生产低聚半乳糖的乳制品。β-D-半乳糖苷酶在乳品工业中有着广泛的应用。β-半乳糖苷酶俗称乳糖酶,不仅能水解乳糖生成半乳糖和葡萄糖,而且具有转糖基活性,是一种重要的糖苷水解酶,在食品、药品和分析化学等领域有重要作用。今年来,随着糖生物学的发展,β-半乳糖苷酶逐渐成为乳糖水解和低聚糖合成的重要工具酶,被用于各种糖基化合物。本实验室筛选出一株马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）SK 16.001,利用发酵的方法可以获得较高转苷活力的β-D-半乳糖苷酶,具有工业化应用潜力,有必要对产β-D-半乳糖苷酶的发酵条件进行优化,并对该酶进行纯化,以进一步研究其催化机制及酶反应动力学参数等。利用马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）SK 16.001进行发酵培养生产β-D-半乳糖苷酶时,通过产酶条件的优化,得到最佳培养基组成为,乳糖质量浓度为20g/L、酵母膏质量浓度10g/L、蛋白胨（鱼粉）质量浓度为20g/L、NaH2PO4 0.04%;最佳的培养条件为:培养基初始pH为6.5、培养温度30℃、摇床转速为150r/min。在这个最适培养条件下酶活力可以达到13.24U/mL。发酵得到的β-D-半乳糖苷酶液样品先后经过硫酸铵分级盐析、透析脱盐、DEAE–Sepharose fast flow离子强度梯度层析、Superdex 75 Prep Grade凝胶过滤后,从发酵液中分离纯化马克斯克鲁维酵母β-D-半乳糖苷酶,纯化酶液经SDS-PAGE电泳鉴定得到单一蛋白条带,计算出β-D-半乳糖苷酶的相对分子质量约为63315。随后研究了纯化后β-D-半乳糖苷酶的酶学性质:β-D-半乳糖苷酶最适反应温度和pH分别为35℃和7.0, Mg2+、Co2+轻微抑制酶活性,Ca2+、Fe2+、Cu2+对酶活的抑制作用较大,Mn2+对酶活有激活作用。然后利用β-D-半乳糖苷酶反应生成低聚半乳糖,其中三糖、四糖得率为13.9%,单糖得率为41.8%。GOS中转移二糖得率为16.2%。总的GOS得率为30.1%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 立题背景
• 1.1.1 低聚半乳糖
• 1.1.2 β-D-半乳糖苷酶来源
• 1.1.3 β-D-半乳糖苷酶的性质
• 1.1.4 β-D-半乳糖苷酶催化乳糖水解和转半乳糖基反应机理
• 1.1.5 β-D-半乳糖苷酶在食品上的应用
• 1.2 研究进展
• 1.3 立题意义
• 1.4 研究内容
• 2 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验菌株
• 2.1.2 实验主要仪器
• 2.1.3 实验主要试剂
• 2.1.4 实验主要材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 发酵条件优化
• 2.2.1.1 种子与摇瓶发酵条件
• 2.2.1.2 粗酶液制备
• 2.2.1.3 乳糖酶水解酶活测定
• 2.2.1.4 乳糖酶转苷酶活力测定
• 2.2.1.5 生物量的测定
• 2.2.1.6 OD 曲线的绘制
• 2.2.1.7 干重曲线的绘制
• 2.2.1.8 发酵培养基酶活曲线的绘制
• 2.2.1.9 温度对酵母产酶的影响
• 2.2.1.10 摇床转速对酵母产酶的影响
• 2.2.1.11 培养基初始pH 对酵母产酶的影响
• 2.2.1.12 碳源优化
• 2.2.1.13 氮源优化
• 2.2.1.14 磷酸盐浓度对酵母产酶的影响
• 2.2.2 酵母细胞破壁方法比较
• 2.2.2.1 对羟基苯甲酸乙酯破壁
• 2.2.2.2 高压均质破壁
• 2.2.3 酶的分离纯化
• 2.2.3.1 粗酶液的制备
• 2.2.3.2 水解酶活力测定
• 2.2.3.3 蛋白质含量测定
• 4）₂SO₄ 分级沉淀'>2.2.3.4 （NH₄）₂SO₄分级沉淀
• 2.2.3.5 透析脱盐
• 2.2.3.6 DEAE-Sepharose fast flow 离子强度梯度层析
• 2.2.3.7 凝胶过滤层析
• 2.2.3.8 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 2.2.4 β-D-半乳糖苷酶的酶学性质
• 2.2.4.1 β-D-半乳糖苷酶反应的最适温度
• 2.2.4.2 β-D-半乳糖苷酶的温度稳定性
• 2.2.4.3 β-D-半乳糖苷酶反应的最适pH 值
• 2.2.4.4 β-D-半乳糖苷酶的pH 值稳定性
• 2.2.4.5 金属离子对β-D-半乳糖苷酶酶活的影响
• 2.2.5 利用β-D-半乳糖苷酶反应生产低聚半乳糖
• 3 结果与讨论
• 3.1 发酵条件优化
• 3.1.1 种子生长曲线
• 3.1.2 发酵产酶曲线
• 3.1.3 培养基初始pH 对酵母产酶的影响
• 3.1.4 摇床转速对酵母产酶的影响
• 3.1.5 温度对酵母产酶的影响
• 3.1.6 碳源优化
• 3.1.7 氮源优化
• 3.1.8 磷酸盐对酵母产酶的影响
• 3.2 酵母细胞破壁研究
• 3.3 分离纯化
• 3.3.1 硫酸铵分级沉淀
• 3.3.2 透析脱盐
• 3.3.3 DEAE–Sepharose fast flow 离子强度梯度层析
• 3.3.4 Superdex 75 Prep Grade 凝胶过滤层析
• 3.3.5 纯化结果及SDS-PAGE 电泳鉴定
• 3.4 β-D-半乳糖苷酶的酶学性质
• 3.4.1 β-D-半乳糖苷酶反应的最适温度
• 3.4.2 β-D-半乳糖苷酶的温度稳定性
• 3.4.3 β-D-半乳糖苷酶反应的最适pH 值
• 3.4.4 β-D-半乳糖苷酶反应的pH 稳定性
• 3.4.5 金属离子对β-D-半乳糖苷酶酶活的影响
• 3.5 利用β-D-半乳糖苷酶生产低聚半乳糖
• 4 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文