昭通天麻共生优良蜜环菌的筛选及特性研究

论文摘要

蜜环菌（Armillaria mellea （Vahl: Fr.） P.Kumm.）是一类具有重要经济价值的高等真菌，除部分菌株侵染树木，造成林木根腐病外，蜜环菌即是著名的食用菌，又具有很高的药用价值，是名贵中药天麻（Gastrodia elata）和猪苓（Grifola umbellala）栽培业必备的共生菌，其优劣直接影响天麻和猪苓产量。云南省昭通市因其独特的地理条件和植被资源，造就了昭通天麻特有的品质，该地区被公认为我国天麻地道药材产地。本研究对分离自昭通地区的15株蜜环菌进行优良菌株的筛选、培养条件优化以及与天麻亲和力等方面的研究，以期为昭通天麻共生密环菌菌种培育和昭通天麻产业向现代化、专业化、规模化发展奠定基础。本实验的主要研究结果如下：（1）对昭通本地分离获得的15株天麻共生蜜环菌的生长特性进行研究，并与1株外地优良天麻共生蜜环菌京-234进行对比。结果发现：各菌株生长速度存在明显差异，菌索平均生长速度从高到低依次为京-234、SNA04、SNA01、SNA11、SNA03、SNA09、SNA05、SNA02、SNA14、SNA10、SNA15、SNA12、SNA13、SNA07、SNA06、SNA08；菌丝和菌索萌发时间、菌索颜色、粗细、分枝状况及荧光强度等生长特性表现最好的是SNA04，其次分别为SNA03、SNA01、SNA05、SNA09、SNA11和SNA02，其余菌株的培养特性均无突出表现。综合评价，15株昭通本地蜜环菌中，菌株SNA04性状最优，SNA03菌株次之。（2）选取2株萌发菌、2种菌材和8株蜜环菌与乌天麻进行组合栽培，测定天麻种子的萌发状况及天麻的产量与数量。发现本地萌发菌SNm-01拌播天麻种子后萌发数量较多；菌材Ⅱ发菌拌栽天麻效果明显好于菌材Ⅰ；8株蜜环菌中，总的以本地蜜环菌SNA04拌栽天麻后得到的产量和数量较为稳定且效果较好。所有组合中，以“石斛小菇-菌材Ⅱ-SNA09”组合得到的天麻产量最高，达1.63Kg/穴，以“石斛小菇-菌材Ⅱ-SNA04”组合得到的天麻数量最多，达205个/穴。（3）SNA01、SNA04和京-2343株菌的rDNA-ITS序列分析及同源性比较结果显示，SNA01的ITS序列与芥黄蜜环菌（Armillaria sinapina）具有96%的同源性；菌株SNA04的ITS序列与高卢蜜环菌（Armillaria gallica）具有99%的同源性；京-234和蜜环菌（Armillaria mellea）具有97%的同源性。初步确定SNA01为芥黄蜜环菌，SNA04为高卢蜜环菌，京-234为蜜环菌。（4）采用单因素试验和正交试验法，以生物量为考察指标，对2株昭通本地天麻共生蜜环菌（SNA03、SNA04）菌索生长条件进行筛选。结果显示：2株菌菌索生长的最适温度为25℃，暗培养下菌索生长速度最快；单糖（葡萄糖）为两菌株生长的最佳碳源，有机氮中的酵母膏和蛋白胨为最佳氮源，最适无机元素为K2SO4（SNA03）和KH2PO4（SNA04），最适维生素为VB2；最佳营养条件组合为A1B3C1D1，即葡萄糖︰酵母膏︰K2SO4（SNA03）/KH2PO4（SNA04）︰VB2=15g/L︰3g/L︰2g/L︰0.005g/L)，其中氮源（酵母膏）是影响菌索生长的最主要因素。（5）在Plackett-Burman试验设计结果基础上，采用响应曲面法对蜜环菌菌索培养条件进行分析、优化。得到各因素的最佳培养基组成为（g/L）：葡萄糖46、乙醇24、酵母膏5、蛋白胨13、K2SO42、KH2PO41、VB20.03、VB10.01。3次重复模型产量验证Y1=4.86g、Y2=4.62g、Y3=4.89g，均值4.79±0.15g与预测产量Y=4.88g相近，验证实验确定了模型的稳定性。（6）用SNA04作菌种，栎树枝条作主要培养基，不同浓度梯度的葡萄糖、乙醇、酵母膏、蛋白胨和土豆汁作辅助营养源培养蜜环菌栽培种。结果显示，与对照相比，加入辅助营养源后，菌索生长速度提高，菌株生长状况得到改良，表现为菌索长势旺、分枝多、色白、粗壮等。其中，菌索在加有250g/L土豆汁菌种瓶中长势最强，平均生长速度达到了1.29cm/d，比对照中的菌索生长速度快0.48cm/d，且土豆是昭通地区主产作物，具有较高产量，可以将其作为蜜环菌栽培种的辅助营养源加以利用。（7）针对蜜环菌菌索极易退化问题，采用不种方法对其进行保藏，结果发现保藏法Ⅲ的保藏效果最好，SNA04菌株在4℃下可存活两年以上且存活率达100%。将已严重退化的蜜环菌菌索接种于4种复壮培养基上进行复壮，生活力均有一定提高，其中1号培养基复壮效果最好，复壮后菌索的生长速度是对照菌索生长速度的1.98倍，且菌索色白、粗壮。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 蜜环菌种类研究
• 1.1.1 蜜环菌分类地位及形态特征
• 1.1.2 蜜环菌生物种
• 1.1.3 蜜环菌的分子鉴定
• 1.2 蜜环菌生长与营养和环境条件的关系
• 1.2.1 营养因素
• 1.2.2 环境因素
• 1.3 蜜环菌与天麻共生关系的研究
• 1.3.1 天麻生长靠蜜环菌提供营养
• 1.3.2 天麻不同生长发育阶段与蜜环菌的关系
• 1.3.3 蜜环菌对天麻的侵染
• 1.3.4 蜜环菌种类对天麻生长的影响
• 1.3.5 昭通天麻共生蜜环菌的研究
• 1.4 蜜环菌的保藏与复壮
• 1.4.1 蜜环菌保藏
• 1.4.2 蜜环菌复壮
• 1.5 本研究的目的及意义
• 2 昭通天麻共生蜜环菌优良菌株筛选
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 供试菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 试验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 生长速度对比
• 2.2.2 其他培养性状比较
• 2.3 结论与讨论
• 3 不同“萌发菌-菌材-蜜环菌”组合对乌天麻产量和数量的影响
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 试验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 不同萌发菌萌发能力比较
• 3.2.2 蜜环菌对天麻的侵染
• 3.2.3 不同“蜜环菌-菌材”组合对天麻产量和数量的影响
• 3.3 结论与讨论
• 4 3 株蜜环菌的 rDNA-ITS 序列分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料来源
• 4.1.2 实验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.3 结论与讨论
• 5 2 株优良天麻共生蜜环菌生长条件筛选
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 实验方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 碳源对菌索生物量的影响
• 5.2.2 氮源对菌索生物量的影响
• 5.2.3 无机元素对菌索生物量的影响
• 5.2.4 维生素对菌索生物量的影响
• 5.2.5 温度对菌索生长速度的影响
• 5.2.6 光照对菌索生长速度的影响
• 5.2.7 正交试验结果
• 5.3 结论与讨论
• 6 蜜环菌SNA04菌株培养条件的响应面分析优化
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 供试菌株
• 6.1.2 培养基
• 6.1.3 试验方法
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 影响蜜环菌菌索生长的重要因子筛选（Plackett-Burman设计法）
• 6.2.2 最陡爬坡试验
• 6.2.3 培养基的响应面优化设计
• 6.3 结论与讨论
• 7 辅助营养源对蜜环菌栽培种的影响
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 菌种
• 7.1.2 菌枝及其处理
• 7.1.3 栽培种的制备
• 7.1.4 试验方法
• 7.2 结果与分析
• 7.2.1 生长速度对比
• 7.2.2 其他培养性状比较
• 7.3 结论与讨论
• 8 蜜环菌的保藏与复壮
• 8.1 材料与方法
• 8.1.1 蜜环菌保藏
• 8.1.2 蜜环菌复壮
• 8.2 结果与分析
• 8.2.1 保藏法对蜜环菌生活力的影响
• 8.2.2 不同培养基对蜜环菌复壮生长的影响
• 8.3 结论与讨论
• 9 结论与展望
• 9.1 结论
• 9.1.1 优良菌株筛选
• 9.1.2 “萌发菌-菌材-蜜环菌”不同组合对天麻产量的影响
• 9.1.3 rDNA-ITS 序列分析
• 9.1.4 生长条件
• 9.1.5 培养条件优化
• 9.1.6 栽培种培养基筛选
• 9.1.7 保藏与复壮
• 9.2 展望
• 参考文献
• 指导老师简介
• 致谢
• 附录
• 图版
• 硕士期间发表论文情况