耐热短链脱氢酶基因的重组表达及其酶特性研究

论文摘要

耐热短链脱氢酶在手性醇合成中有很大的应用潜力。本文以一个来自极端嗜热菌Carboxydothermus hydrogenoformans SP.的短链脱氢酶SDR3为研究对象,在将其基因异源表达的基础上,考察了与不对称还原转化相关的一些酶学性质,测定了其催化底物谱,并选取其中一个底物进行了生物催化工艺开发的前期研究。短链脱氢酶基因sdr3的开放阅读框长为747bp,编码248个氨基酸残基,具有典型短链脱氢酶的保守位点。利用表达载体pET28a构建了该基因的重组表达质粒并进行了表达和优化。最佳诱导表达条件为：培养温度25℃,诱导剂IPTG浓度0.05mmol/L,诱导时间14h。将重组酶SDR3纯化后,研究了其酶学性质。结果显示对α酮酯有较高的活性,反应最佳温度为70℃,最佳pH为6.0。该酶具有较高的热稳定性,70。C处理15mmin后仍较为稳定,残余相对酶活达90%以上。在1mM终浓度下,重金属离子Zn2+和Co2+对酶活有显著的抑制作用。以重组酶SDR3为催化剂,以苯甲酸甲酰乙酯为底物,进行手性醇不对称合成的研究。利用葡萄糖脱氢酶GDH为辅助酶构建辅酶NADH循环再生系统,能大大降低反应过程中NADH的消耗。最终构建的反应体系在6h内能催化苯甲酸甲酰乙酯不对称还原合成R-扁桃酸乙酯,产率为55.27%,e.e.值为99.3%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 短链脱氢酶简介
• 1.1.1 短链脱氢酶来源
• 1.1.2 短链脱氢酶催化的反应类型
• 1.1.3 短链脱氢酶的结构
• 1.2 超嗜热菌短链脱氢酶简介
• 1.2.1 超嗜热菌及其耐热酶
• 1.2.2 基因来源
• 1.2.3 蛋白序列比较
• 1.2.4 底物特异性
• 1.2.5 超嗜热短链脱氢酶的稳定性
• 1.2.5.1 pH的作用
• 1.2.5.2 热稳定性
• 1.2.5.3 金属离子和金属螯合剂的影响
• 1.2.5.4 对有机试剂的耐性
• 1.2.6 耐热性分析
• 1.2.7 耐热脱氢酶在制药工业中的应用
• 1.3 手性技术的应用及研究现况
• 1.3.1 手性化合物与手性药物
• 1.3.2 手性醇
• 1.3.3 手性化合物的制备方法
• 1.3.3.1 手性源合成法
• 1.3.3.2 外消旋体拆分法
• 1.3.3.3 不对称合成法
• 1.4 生物法催化不对称还原合成手性醇
• 1.4.1 全细胞催化与纯酶催化的比较
• 1.4.2 酶法辅酶再生循环系统构建
• 1.4.2.1 底物耦联法
• 1.4.2.2 酶耦联法
• 1.4.3 基因工程技术的运用
• 1.5 本文的立题依据和研究内容
• 1.5.1 立题依据
• 1.5.2 研究内容
• 第二章 耐热短链脱氢酶基因的重组表达及优化
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株和载体
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 培养基与溶液
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 基因编码序列的分析
• 2.2.2 重组表达质粒和表达菌株的构建
• 2.2.3 重组蛋白的诱导表达
• 2.2.4 表达产物SDS-PAGE电泳分析
• 2.2.5 重组表达优化
• 2.2.5.1 不同IPTG浓度的诱导表达
• 2.2.5.2 不同温度的诱导表达
• 2.2.5.3 不同时间的诱导表达
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 序列分析结果
• 2.3.2 重组表达质粒和表达菌株的构建
• 2.3.3 重组菌表达及产物检测
• 2.3.4 重组表达优化
• 2.4 本章主要结论和成果
• 第三章 重组耐热短链脱氢酶SDR3的分离纯化及酶学性质研究
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 实验菌株
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要溶液与缓冲液
• 3.1.4 主要仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 酶的热处理
• 3.2.2 重组蛋白纯化
• 3.2.2.1 纯化原理
• 3.2.2.2 纯化步骤
• 3.2.3 醇脱氢酶活力测定
• 3.2.3.1 酶活测定原理
• 3.2.3.2 酶活力测定体系
• 3.2.3.3 酶活测定过程
• 3.2.4 短链脱氢酶SDR3酶学性质研究
• 3.2.4.1 底物特异性
• 3.2.4.2 温度对酶活力的影响及热稳定性
• 3.2.4.3 pH对酶活力的影响
• 3.2.4.4 金属离子等对酶活影响
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 酶的热处理
• 3.3.2 重组蛋白的分离纯化
• 3.3.3 短链脱氢酶SDR3酶学性质研究
• 3.3.3.1 底物特异性
• 3.3.3.2 最适酶反应温度和酶热稳定性
• 3.3.3.3 最适酶反应pH
• 3.3.3.4 金属离子等对酶活影响
• 3.4 本章主要结论和成果
• 第四章 重组耐热短链脱氢酶SDR3不对称转化苯甲酰甲酸乙酯的研究
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 实验菌种
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 主要仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 液相分析方法建立
• 4.2.2 不对称转化方法建立
• 4.2.3 辅酶NADH循环系统构建
• 4.2.4 反应体系优化
• 4.2.4.1 反应温度影响
• 4.2.4.2 反应时间影响
• 4.2.4.3 SDR3浓度影响
• 4.2.4.4 GDH浓度影响
• 4.2.4.5 初始NADH浓度影响
• 4.2.4.6 GDH含量再次优化
• 4.2.5 参量的计算
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 液相分析方法建立
• 4.3.2 不对称反应及辅酶循环系统结果
• 4.3.3 反应体系优化
• 4.3.3.1 反应温度和反应时间
• 4.3.3.2 SDR3浓度优化
• 4.3.3.3 GDH浓度优化
• 4.3.3.4 初始NADH浓度优化
• 4.3.3.5 GDH浓度再次优化
• 4.4 本章主要结论和成果
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录